Studiul metabolizării glucozei in vivo la șoarecii alimentați cu diete bogate în grăsimi utilizând testul de toleranță orală la glucoză

rezumat

Articolul curent descrie generarea și caracterizarea metabolică a șoarecilor hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi ca model de rezistență la insulină și obezitate indusă de dietă. De asemenea, are protocoale detaliate pentru efectuarea testului oral de toleranță la glucoză și testul de toleranță la insulină, monitorizarea întregului corp, modificări ale metabolismului glucozei in vivo.

șoarecii

Abstract

Introducere

În țările dezvoltate, obezitatea și diabetul au atins dimensiuni epidemice din cauza inactivității fizice și a consumului excesiv de alimente procesate, efecte care sunt determinate de urbanizarea rapidă, industrializare și globalizare. Deși cercetările privind rezistența la insulină și comorbiditățile sale, cum ar fi hiperlipidemia și ateroscleroza, au căpătat importanță în ultimele decenii, mecanismele biologice complexe care reglează metabolismul în sănătate și boală rămân incomplet înțelese și există încă o nevoie urgentă de noi modalități de tratament care să prevină și să trateze aceste boli 1 .

Insulina și glucagonul hormonilor săi de reglare servesc drept principalii regulatori ai aprovizionării cu energie celulară și echilibrului macronutrienților, menținând astfel și concentrații sistemice adecvate de glucoză din sânge 2. Glucoza în sine acționează ca unul dintre principalii stimulatori ai secreției de insulină de către celulele β pancreatice, în timp ce alți macronutrienți, factori umorali precum aportul neuronal modifică în continuare acest răspuns. În consecință, insulina declanșează procesele anabolice ale stării hrănite facilitând difuzia excesului de glucoză din sânge în celulele musculare și grase și activând în continuare glicoliza, precum și sinteza proteinelor sau respectiv a acizilor grași. Mai mult, insulina suprimă producția de glucoză hepatică prin inhibarea gluconeogenezei. Consumul excesiv de energie cronică și metainflamarea conduc la hiperinsulinemie și rezistență la insulină periferică datorită reglării în jos a expresiei receptorilor de insulină, precum și modificări ale căilor de semnalizare în aval, rezultând o sensibilitate afectată la eliminarea glucozei mediată de insulină, precum și o inhibare insuficientă a producția de glucoză hepatică 3, 4, 5, 6 .

O gamă largă de modele animale cu inducție genetică, nutrițională sau experimentală a bolii s-au dovedit a fi instrumente excelente pentru studiul mecanismelor moleculare de rezistență la insulină și a diferitelor forme de diabet, precum și a bolilor sale însoțitoare 7. Un exemplu este modelul de șoarece indus de HFD, utilizat pe scară largă și bine stabilit, care se caracterizează printr-o creștere rapidă în greutate datorită aportului alimentar crescut în combinație cu o eficiență metabolică mai mică, rezultând rezistență la insulină 8, 9. Atât la modelele animale, cât și la cele umane, o creștere a glicemiei și insulinei în jeun, precum și o toleranță redusă la administrarea glucozei sunt utilizate ca indicatori ai rezistenței la insulină și a altor tulburări sistemice ale metabolismului glucozei. Monitorizarea nivelurilor de glucoză și insulină din sânge la momentul inițial sau post-stimul sunt citiri ușor accesibile.

În general, oferim un protocol simplu pentru a genera un model de șoarece indus de HFD, în timp ce descriem în continuare două abordări puternice pentru a studia tulburările metabolice ale întregului corp, SUA și ITT, care pot fi instrumente utile pentru studiul patogeniei boală și dezvoltarea de noi terapii, în special în domeniul bolilor asociate metabolismului, cum ar fi rezistența la insulină și diabetul.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Protocol

Toate metodele descrise aici au fost aprobate de Îngrijirea și Utilizarea Animalelor de la Universitatea de Medicină din Viena și efectuate în conformitate cu Federația Asociațiilor Europene de Știință a Animalelor de Laborator (Personal). Vă rugăm să rețineți că toate procedurile descrise în acest protocol trebuie efectuate numai după aprobarea instituțională și guvernamentală, precum și de către personalul care este competent din punct de vedere tehnic.

1. Șoareci alimentați cu HFD

Notă: Păstrați toți șoarecii C57BL/6J pe un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore, cu acces gratuit la alimente și apă.

  1. La vârsta de 6 săptămâni, șoarecii plasează timp de 8-12 săptămâni pe un HFD (40-60% calorii din grăsimi) pentru a induce obezitatea, în timp ce hrănesc grupul de control slab o dietă cu conținut scăzut de grăsimi (LFD) (10% calorii din grăsimi).
  2. Determinați greutatea corporală a șoarecilor săptămânal. Curbele de greutate ar trebui să prezinte modele similare în ambele grupuri, cu o pantă mai mare în grupul alimentat cu HFD.

Notă: Dacă punctele de timp de prelevare a sângelui sunt alese în timpul OGTT la fiecare 15 minute, experimentul trebuie efectuat cu maximum 15 șoareci în paralel, pentru a avea cel puțin 1 minut de timp de manipulare pe șoarece.

Notă: Aceleași măsuri de precauție descrise pentru OGTT (manipularea șoarecilor, sângelui, glucometrului și utilizarea vaselinei) ar trebui, de asemenea, aplicate atunci când se efectuează ITT. De exemplu, toate injecțiile trebuie efectuate în decurs de 15 minute la intervale de 1 minut dacă 15 șoareci sunt testați în paralel. Pentru ITT, colectarea ulterioară a probelor de sânge cu tuburi capilare este opțională.

10 minute la șoareci 13, diferențele finale după administrarea insulinei (de exemplu, după 2 ore) nu pot reflecta un efect direct al acțiunii insulinei. Administrați soluție de glucoză 20% în cazul unui șoarece hipoglicemiant (niveluri sub 35 mg/dL de glucoză în sânge) și prezintă riscul de moarte.

  • După ultimele puncte de timp, așezați șoarecii în cuștile de acasă pregătite cu multă mâncare și apă.

    • Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

    Rezultate reprezentative

    Fig. 1 prezintă un program pentru fenotiparea metabolică a șoarecilor în dietă. La o vârstă de aproximativ 6 săptămâni, șoarecii ar trebui să fie plasați într-un HFD, în timp ce un grup LFD poate servi ca grup de control. Foarte important, greutatea corporală trebuie determinată săptămânal pentru a vedea dacă se așteaptă o creștere a greutății corporale. Orice tip de stres (de exemplu, zgomot sau comportament agresiv al bărbatului) poate interfera cu creșterea în greutate corporală și trebuie eliminat imediat. Fiecare cohortă de șoareci pentru experimentele dietetice trebuie să fie formată din cel puțin 10 șoareci, deoarece aceste experimente dietetice sunt lente și florile sunt frecvente (de exemplu, șoarecii nu se îngrașă sau șoarecii cu niveluri anormale de glucoză sau insulină). După perioada de timp selectată (în funcție de ipoteza studiului și de momentul modificărilor așteptate), OGTT și ITT pot fi efectuate pentru evaluarea acțiunii insulinei și a toleranței la glucoză. În această lucrare, au fost alese momentele finale pentru testul metabolic.