Izolarea, caracterizarea și purificarea macrofagelor din țesuturile afectate de
rezumat
Acest protocol permite unui investigator să izoleze și să caracterizeze țesutul macrofagic rezident în diferite țesuturi de focă inflamate extrase din modele de tulburări metabolice induse de dietă.
Abstract
Introducere
Modelele de șoareci au fost folosite pentru a studia dinamica bolilor umane. Izolarea corectă a celulelor rezidente din țesutul șoarecilor într-o stare bolnavă poate oferi o platformă pentru înțelegerea contribuțiilor moleculare și celulare la patogeneza unei boli 1. O tulburare de importanță vitală este obezitatea. Incidența obezității continuă să crească în întreaga lume, în paralel cu rezistența la insulină și diabetul zaharat de tip 2, bolile cardiovasculare și bolile hepatice grase 2, 3. Consumul excesiv de nutrienți este mai mult influențat de o scădere a activității fizice care determină modificarea semnalelor din țesutul adipos, care poate modifica mediul celular al altor țesuturi periferice, cum ar fi ficatul și aorta 4. O astfel de perturbare a homeostaziei metabolice are ca rezultat o inflamație sistemică cronică de 5 .
Activarea clasică a rezidentului în aortă și ficat, precum și recrutarea acestuia în țesutul adipos alb de macrofage (WAT) s-a dovedit nu numai că inițiază neregularea semnalelor metabolice, ci și susține inflamația 6, 7. Heterogenitatea fenotipică și funcțională a macrofagelor este puternic asociată cu patogeneza obezității legată de comorbidități. Plasticitatea dinamică a polarizării macrofagelor permite acestor celule să prezinte o varietate de fenotipuri activate care coordonează progresia și rezoluția inflamației. În timp ce macrofagele activate clasic (M1) sunt implicate în răspândirea inflamației, macrofagele activate (M2) au fost asociate cu rezoluția și repararea țesuturilor 9, 10 .
Pe măsură ce corpul suferă stres metabolic, țesutul adipos alb se acumulează anormal. Țesutul adipos mărit atrage și reține celulele inflamatorii care modifică profund funcția normală a adipocitelor pentru a promova rezistența la insulină, hiperglicemia și diabetul zaharat de tip 2, în cele din urmă rezistența la insulină sau hiperglicemia 11, 12. În paralel, remodelarea țesutului adipos alb ca răspuns la semnale inflamatorii prin infiltrarea macrofagelor clasice activate (ATM-uri) a țesutului adipos (M1) de 13, 14. Acest organ multicelular exercită o cascadă de semnale care deraiază funcția normală a altor organe ale corpului, cum ar fi aorta și ficatul. .
Ficatul este o putere metabolică care se adaptează ca răspuns la stimulii din WAT 15 foarte neregulat. Macrofagele hepatice sau celulele Kupffer, ca răspuns la modificările metabolice, secretă citokine inflamatorii care transformă atât parenchimul, cât și fenotipul celulelor non-parenchimatoase și promovează remodelarea țesuturilor. Acumularea de lipide hepatice, inflamație, depozite excesive de matrice extracelulară, necroză și eventuală pierdere a funcției urmează insultelor inflamatorii care contribuie la gama largă de leziuni hepatice asociate cu boala hepatică grasă nealcoolică 16 17, din, 18 .
În paralel cu WAT și funcția hepatică compromise, arterele mari acumulează lipide în peretele arterial pe măsură ce corpul suferă stres metabolic cronic 19. Acumularea de lipide arteriale declanșează secreția de chemokine de către celulele endoteliale activate și recrutarea ulterioară a monocitelor 20. Odată recrutați, monocitele proliferează, se diferențiază, ingeră lipoproteine și devin celule spumante. Aterogeneza este inițiată și susținută de activitatea pro-inflamatorie a macrofagelor recrutate și încărcate de lipide rezidente în țesuturi. Sucumbând la semnale de stres extracelular și intracelular transmise în acest microambient aterogen, aceste macrofage participă apoi la o cascadă de semnalizare a apoptozei. Pe măsură ce aceste celule spumante mor, ele contribuie la conținutul lor de lipide care umple baza necrotică a leziunii, ceea ce duce apoi la ruperea plăcii, infarctul miocardic și accident vascular cerebral.
Colectiv, eterogenitatea fenotipurilor de macrofage organizează parțial obezitatea indusă de modificări inflamatorii în țesuturile normale, cum ar fi WAT, ficat și aorta 8, 21. Caracterizarea macrofagelor recrutate și rezidente poate oferi o perspectivă asupra potențialelor ținte moleculare care manipulează fenotipul 1 al macrofagelor. Pentru a caracteriza în mod eficient macrofagele din țesuturile inflamate induse de obezitate, se poate obține o suspensie unicelulară prin digestie enzimatică. Astfel de protocoale de disociere trebuie să fie eficiente în degradarea suficientă a țesutului conjunctiv, reducând în același timp moartea celulelor imune și asigurând performanțe celulare optime. Amestecul enzimatic depinde de tipul de țesut și de structura sa structurală. Țesuturile rezistente, cum ar fi aorta, necesită o activitate enzimatică mai mare, în comparație cu ficatul și WAT, pentru a realiza disocierea țesuturilor. Din suspensia celulară, macrofagele rezidente pot fi caracterizate fără echivoc sau izolate pentru analize ulterioare în aval, cum ar fi profilarea transcripțională.