Ehrlichia canis la câini aparent sănătoși și la căpușe din patru municipalități din

UNIVERSIDAD AGRARIA DE LA HABANA Facultatea de Medicină Veterinară Fructuoso Rodríguez Pérez Ehrlichia canis la câini și căpușe aparent sănătoși din patru municipalități din vestul Cubei Teză ca opțiune pentru diploma științifică de doctor în științe veterinare Autor: DMV Maylín González Navarrete, M. Sc Tutori: DMV Adivaldo Henrique Da Fonseca, Dr. C. DMV Eugenio Roque López, Dr. C. Consilieri: DMV María Antonia Abeledo García, Dr. C. Lic. Belkis Corona González, Dr. C. Mayabeque, 2018

Dedicație Pentru noi toți cei care visăm să păstrăm să conservăm pentru a menține integritatea naturii și a animalelor ca parte a acesteia. Pentru noi toți care nu încetăm să visăm, să luptăm, să investigăm și să căutăm mereu cel mai bun mod de a ne păstra. Noilor generații, pe care avem datoria să le onorăm cu munca și ghidul nostru, pregătindu-ne fiecare zi mai bine, astfel încât exemplul nostru să fie cel mai bun mod de a preda.

Tabelul index Tabelul 1. Extensia suprafeței, densitatea populației și densitatea canină a municipalităților eșantionate. 38 Tabelul 2. Cantitatea de amestecuri de căpușe în funcție de etapa din fiecare municipalitate. 41 Tabelul 3. Grundurile utilizate pentru detectarea E. canis prin PCR imbricat. 42 Tabelul 4. Programele de amplificare pentru fiecare test PCR imbricat (Murphy și colab., 1998). 43 Tabelul 5. Procentul de câini cu anticorpi IgG împotriva E. canis în funcție de vârstă, rasă și sex. 56 Tabelul 6. Numărul câinilor și caselor eșantionate în funcție de municipalitate. Distribuția caselor eșantionate în funcție de numărul de câini pe casă. 60 Tabelul 7. Numărul de căpușe colectate și câini infestați de municipalitate. 65 Tabelul 8. Clasificarea intensității infestării de R. sanguineus s.l. la câinii eșantionați 70 Tabelul 9. Extinderea infestării cu R. sanguineus s.l. în municipiile studiate. 70 Tabel 10. Relația variabilelor și pozitivitatea cu E. canis prin PCR imbricată în patru municipalități din regiunea de vest a Cubei (regresie logistică univariată). 86 Tabel 11. Factorii de risc asociați cu pozitivitatea la E. canis prin PCR cuibărit în patru municipalități din regiunea de vest a Cubei. (Regresie logistică multivariată). 87

100 bp (Promega, Madison, SUA); Linia 2 și 3: control negativ; Linii 4-15: bifați amestecuri de ADN, Linia 16: control pozitiv. 77 Figura 15. Procentul câinilor eșantionați în funcție de categoria de vârstă. 84

Lista abrevierilor, acronimelor și simbolurilor ADN: acid dezoxiribonucleic Ca Cl2: clorură de calciu dntps: trifosfați dezoxiribonucleotidici EDTA: acid etilendiaminetetraacetic ELISAi: enzimă indirectă test imunosorbent IFI: imunoflorescență indirectă L: clorură Mg2: clorură de sodiu mg: clorură de sodiu mililitru mm: milimolar SAU: cota rație pb: perechi de baze PBST: soluție salină tamponată cu fosfat pH 7,2-7,4 cu 5% Tween 20 PBS: soluție salină tamponată cu fosfat PCR: reacție în lanț polimerază ph: potențial hidrogenionic pmol: picomol ARN: acid ribonucleic ribosomal rpm: rotații pe minut TAE: tampon Tris-Acetat-EDTA Taq: enzimă ADN polimerază izolată din bacteria Thermus aquaticus U: unitate V: volți µg: microgramă µl: microlitru µm: micromolar 16S rrna: 16S porțiune de ARN ribozomal: Marcă comercială C: Celsius grad

INDEX GENERAL INTRODUCERE. 2 Ipoteză. 5 Obiectiv general. 5 Obiective specifice. 5 NOUĂ ȘI CONTRIBUȚIE ȘTIINȚIFICĂ. 7 CAPITOLUL I. REVIZUIRE BIBLIOGRAFICĂ. 8 1.1. Conceptul și istoria ehrlichiozei monocitare canine. 8 1.2. Agent etiologic. 9 1.2.1. Taxonomia E. canis. 10 1.2.2. Morfologie. 10 1.3. Epidemiologia ehrlichiozei canine. 11 1.3.1. Distribuția geografică a E. canis. 11 1.3.2. Vectori. 12 1.3.3. Gazde. 19 1.3.4. Transmiterea E. canis. 20 1.3.5. Factorii de risc asociați cu infecția cu E. canis. 21 1.4. Patogenia ehrlichiozei canine. 23 1.4.1. Tablou clinic. 25 1.5. Diagnosticul E. canis. 27 1.5.1. Diagnosticul prin frotiu de sânge. 28 1.5.2. Cultură de celule. 29 1.5.3. Diagnosticul serologic. 30 1.5.4. Diagnosticul molecular prin reacția în lanț a polimerazei în gazdă. 31 1.5.5. Detecția moleculară în vector. 32 1.5.6. Diagnostic diferentiat. 33 1.5.7. Infecții multiple sau co-infecții. 33 1.6. Prevenirea și controlul erlichiozei canine. 34 1.6.1. Prevenirea. 34 1.6.2. Controlul căpușei R. sanguineus. 35 CAPITOLUL II. MATERIALE ȘI METODE GENERALE. 38

4.3.5. Identificarea caselor cu câini infestați de R. sanguineus s.l. 71 4.2.4. Concluzii parțiale. 73 CAPITOLUL V. Ehrlichia canis în căpușe colectate de la câinii prelevați în municipalitățile studiate. 75 5.1. Introducere. 75 5.2. Materiale și metode. 76 5.2.1. Colectarea și conservarea căpușelor. 76 5.2.2. Analiza PCR imbricată. 76 5.2.3. Secvențierea și analiza fragmentelor amplificate. 76 5.3. Rezultate si discutii. 76 5.4. Concluzie parțială. 79 CAPITOLUL VI. Factorii de risc asociați cu Ehrlichia canis la câinii aparent sănătoși domiciliați în municipiile Habana del Este, Boyeros, Cotorro și San José de las Lajas. 81 6.1. Introducere. 81 6.2. Materiale și metode. 82 6.2.1. Caracterizarea populației eșantionate. 82 6.2.2. Chestionar epidemiologic. 82 6.2.3. Analiza statistică. 83 6.3. Rezultate si discutii. 83 6.3.1. Caracterizarea populației de câini eșantionați. 83 6.3.2. Analiza factorilor de risc. 85 6.4. Concluzie parțială. 91 CAPITOLUL VII. Discutie generala. 92 VIII. CONCLUZII GENERALE. 98 IX. RECOMANDĂRI. 100 X. REFERINȚE BIBLIOGRAFICE. 1 IX. ANEXE. 1

Introducere 4. Identificați factorii de risc asociați cu infecția cu E. canis la câinii domestici aparent sănătoși din municipalitățile investigate. 6