Stabilirea modelului de șoarece dublu umanizat TK-NOG pentru patogeneza hepatică asociată cu HIV

rezumat

Acest protocol oferă o metodă de încredere pentru a stabili șoareci umanizați cu sistemul imunitar uman și celulele hepatice. Șoarecii imunodeficienți dubli reconstituiți obținuți prin injectarea intrasplenică de hepatocite umane și celule stem hematopoietice CD34 + sunt susceptibile la infecția cu virusul 1 a imunodeficienței umane și la recapitularea leziunilor hepatice observate la pacienții infectați cu HIV.

Abstract

Introducere

De la apariția terapiei antiretrovirale, a existat o scădere substanțială a deceselor legate de monoinfecția cu HIV-1. Cu toate acestea, boala hepatică a apărut ca o cauză comună de morbiditate la pacienții infectați cu HIV 1, 2. Co-infecțiile cu virusul hepatitei cu infecția cu HIV-1 sunt mai frecvente, reprezentând între 10% și 30% dintre persoanele infectate cu HIV din Statele Unite 3, 4, 5 .

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Protocol

Acest protocol a fost aprobat de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor (IACUC) de la Centrul Medical al Universității din Nebraska.

NOTĂ: Obțineți aprobarea IACUC locală înainte de a efectua experimente pe animale.

1. Prelucrarea sângelui din cordonul ombilical și izolarea shumano HSpC

2. Pregătirea hepatocitelor umane pentru transplant

  1. Îndepărtați hepatocitele crioconservate din azot lichid, scufundați rapid flaconul în baia de apă și dezghețați aproximativ 90 - 120 s.
  2. Îndepărtați capacul din flacon și turnați hepatocitele dezghețate în tubul conic de 50 ml al mediului de dezgheț încălzit.
  3. Suspendați celulele legând manual tubul de 50 ml timp de câteva secunde.
    NOTĂ: Nu rotiți tubul.
  4. Respingeți celulele la 100 x g timp de 8 minute la temperatura camerei. Se spală celulele peletate în PBS cu 0,1% BSA și se agită cu HSCC proaspăt sau dezghețat (raport 10: 1) în PBS într-un volum final de 80 μl/șoarece.

3. Managementul animalelor, screening-ul, genotiparea și tratamentul pentru hSPC uman și transplant de hepatocite

4. Validarea grefei hepatice umane de către ELISA și a sistemului imunitar uman prin citometrie în flux

NOTĂ: Evaluați reconstituirea ficatului uman și a sistemului imunitar lunar, începând cu o lună după transplant prin test imunosorbent legat de enzime (ELISA) și, respectiv, citometrie în flux.

5. Infecția cu HIV a șoarecilor TK-NOG și efectul acesteia asupra ficatului și sistemului imunitar uman

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Rezultate reprezentative

dublu

figura 1 : Schema de îmbogățire a celulelor CD34 + din sângele din cordonul ombilical. (LA) Sângele din cordonul ombilical este stratificat în mediu de separare a limfocitelor (LSM) și centrifugat pentru a izola stratul tampon. () Coloanele LS sunt așezate pe un suport magnetic și clătite cu tampon BSA, urmate de adăugarea unui strat tampon. Celulele pozitive pentru CD34 sunt prinse în coloane, iar celulele CD34 sunt eluate în tuburi separate. Celulele CD34 + prinse în rășini de coloană sunt cufundate, iar celulele sunt colectate într-un tub nou. Faceți clic aici pentru a vizualiza o versiune mai mare a acestei figuri.


Figura 4 : Concentrația de albumină este măsurată prin ELISA în serul șoarecilor umani duali. Șoarecii sunt transplantați cu hepatocite umane (HEPs) și CD34 + celule stem/progenitoare hematopoietice (HSPC) (# 11). Serul este colectat în momente diferite la 1, 4 și 6 luni după transplant, iar diluțiile se fac pentru a se adapta la concentrațiile de probe necunoscute în gama standardelor. Fiecare simbol reprezintă o valoare individuală a mouse-ului. Rezultatele reprezintă mediana, precum și valorile individuale. * P 8. Faceți clic aici pentru a vizualiza o versiune mai mare a acestei figuri.