În abordările de electroporare în utero pentru a studia excitabilitatea subpopulațiilor neuronale și
rezumat
Acest manuscris oferă protocoale care se utilizează în electroporare uterină (SUI) pentru a descrie conectivitatea structurală a neuronilor la nivelul celulei unice și excitabilitatea neuronilor marcați fluorescent. Histologia este utilizată pentru a caracteriza proiecțiile dendritice și axonale. Înregistrarea celulelor întregi în felii ascuțite este utilizată pentru a investiga excitabilitatea.
Abstract
Sistemul nervos este alcătuit dintr-o gamă imensă de diferite tipuri neuronale. Aceste subpopulații neuronale se caracterizează prin, printre alte caracteristici, morfologiile lor dendritice distincte, tiparele lor specifice de conectivitate axonală și răspunsurile lor de tragere selectivă. Mecanismele moleculare și celulare responsabile de aceste aspecte ale diferențierii în timpul dezvoltării sunt încă slab înțelese.
În continuare, descriem protocoalele combinate pentru marcarea și caracterizarea conectivității structurale și a excitabilității neuronilor corticali. Modificarea protocolului de electroporare in utero (SUI) permite marcarea unei populații rare de neuroni. Acest lucru, la rândul său, permite identificarea și monitorizarea dendritelor și axonilor neuronilor individuali, caracterizarea precisă a locației laminare a proiecțiilor axonale și analiza morfometrică. SUI poate fi, de asemenea, utilizat pentru a investiga modificările excitabilității neuronilor de tip sălbatic (WT) sau modificate genetic prin combinarea feliilor acute cu înregistrarea cu celule întregi a creierelor electroporate. Aceste două tehnici contribuie la o mai bună înțelegere a cuplării conectivității structurale și funcționale și a mecanismelor moleculare care controlează diversitatea neuronală în timpul dezvoltării. Aceste procese de dezvoltare au implicații importante pentru cablarea axonală, diversitatea funcțională a neuronilor și biologia tulburărilor cognitive.
Introducere
Dezvoltarea structurilor dendritice și axonale este o fațetă importantă a reglării circuitului în sistemul nervos, inclusiv în cortexul cerebral. Acesta joacă un rol critic în timpul cablării selective a diferitelor subpopulații neuronale. Mai multe rapoarte recente au arătat că, pe lângă conectivitate, diversitatea moleculară a neuronilor se reflectă prin achiziționarea unor moduri de tragere foarte specifice. Cu toate acestea, mecanismele care determină excitabilitatea și conectivitatea diferitelor subtipuri neuronale în timpul dezvoltării, precum și gradul lor de coordonare, sunt încă slab înțelese. 1, 2.
Deși acest protocol descrie electroporarea șoarecilor în ziua embrionară (E) 15,5, această tehnică poate fi efectuată la orice vârstă cuprinsă între E9,5 și 3 zile postnatal (P) 2 4. În timp ce în stadiile incipiente ale Electroporației vizează neuroni și precursori ai talamusul și straturile profunde ale cortexului, o electroporare în stadiu mai avansat marchează straturi mai superficiale (de exemplu, neuronii E15.5 IUE strat II-III). Pe scurt, combinația SUI cu analiza morfologică unicelulară și electrofiziologia este un instrument util pentru a elucida mecanismele moleculare care stau la baza enormei diversități structurale și funcționale a neuronilor din sistemul nervos.
Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.
Protocol
Toate procedurile pentru animale au fost aprobate de Comisia de îngrijire și ocupare a animalelor din Comunitatea Madrid, în conformitate cu legislația națională și europeană (PROEX 118/14; PROEX 331/15). Mențineți condiții sterile în timpul procedurii.
1. Electroporare în uter
NOTĂ: Acest protocol pentru SUI este o adaptare a altora care au fost publicate anterior 5, 6, 7. Acest manuscris descrie un protocol pentru SUI al embrionilor E15.5, cu modificări în strategia raportorului care permite studiul morfologiei a 8 persoane neuronii și proprietățile lor electrofiziologice într-un experiment separat folosind plasmide reporter standard GFP.
2. Pregătirea pentru chirurgie
- Efectuați o intervenție chirurgicală de supraviețuire utilizând proceduri aseptice. Garantează condiții sterile, cum ar fi măști, mănuși, instrumente și câmp chirurgical. Sterilizați instrumentele chirurgicale (bisturiu, pensă Adson, foarfece fine întărite, foarfece curbate, pensă Dumont și suport pentru ac).
- Selectați capilarele din sticlă borosilicată OD de 1/0,58 mm. Flip Capillaries 3. Orientare pentru o lungime optimă a vârfului de 1 cm după tragere. Tăiați vârful acului la un unghi de 30 ° folosind o pensetă fină (Figura 1B).
- Pregătiți 500 ml de soluție izotonică sterilă (1x PBS sau Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)). Adăugați penicilină-streptomicină 1: 100 și încălziți această soluție la 37 ° C. Poate fi păstrată la 4 ° C după operație.
- Se injectează subcutanat o doză preoperatorie de analgezice (de exemplu, carprofen, 5 mg/kg greutate corporală).
- Menținerea animalelor calde pentru operație prin plasarea lor pe un tampon de încălzire. Încălzirea unei cuști curate la 37 ° C în timpul recuperării postoperatorii.
- Anesteziați un șoarece C57BL/6 E15.5 însărcinat cu izofluran. Mai întâi, infuzați o cameră închisă cu 3% izofluran în 0,8 L/min oxigen și lăsați mouse-ul în interior până când adormiți. Transferați mouse-ul într-o compresă caldă și puneți nasul și gura în interiorul unei măști de livrare a izofluranului. Reduceți treptat anestezia în timpul intervenției chirurgicale la 1,5% izofluran prin mască. Confirmați o anestezie adecvată observând o pierdere a reflexului pedalei (ciupirea degetelor de la picioare). Procedura optimă durează aproximativ 20 de minute și nu mai mult de 45 de minute.
- Aplicați unguent pentru ochi pentru a preveni uscarea ochilor în timpul procedurii.
- Îndepărtați părul dintr-o regiune de
La 3 cm de abdomen (folosind un aparat de ras electric sau o cremă depilatoare). Spălați zona chirurgicală cu tampoane de bumbac impregnate cu etanol 70%, urmate de un tampon de bumbac infuzat cu iod. Repetați de trei ori.