Subunitatea β a glucozidazei II, un substrat nou pentru activitatea asemănătoare caspazei-3 în
Subiecte
rezumat
Introducere
Rezultate
Gas2/HSP90/HSP40 au format un complex proteic legat de caspază-3 în celulele cu suspensie de orez sub stres termic
( la ) Fracțiile active de caspază-3 din coloana G-75 au fost reunite și purificate în continuare pe o coloană Mono-Q echilibrată cu tampon Tris/HCI 20 mM, pH 8,0. Proteinele au fost eluate cu un gradient de NaCl (0
1 M) într-un tampon Tris/HCI 20 mM, pH 8,0, la un debit de 1 ml/min. Proteinele au fost detectate prin absorbanță la 280 nm. Vârfurile au fost colectate, respectiv. ( ) Un număr egal de vârfuri colectate din coloana Mono-Q au fost incubate cu Ac-DEVD-AMC. Fluorescența AMC a fost măsurată de un cititor de microplăci la 30 ° C. RFU/oră a reprezentat diferențele relative ale unității de fluorescență produse în 1 oră. I și II reprezintă vârfurile care au prezentat activitate asemănătoare caspazei-3.
Imagine la dimensiune completă
Masă completă
Profilul de exprimare Gas2 sub diferite tensiuni.
În condiții fiziologice, Gas2 este o subunitate necatalitică a glucozidazei II, care participă la glicozilarea proteinelor din ER. Pentru a identifica funcțiile biologice ale Gas2 sub stres abiotic, expresia Gas2 a fost măsurată printr-o reacție în lanț cantitativă în timp real a polimerazei în diferite condiții, chiar și sub stres ER indus de DTT. Tratamentul cu DTT de 6,4 mM a indus expresia Os bZIP50 34, gena marker pentru UPR, care a indicat faptul că DTT a fost capabil să inducă stresul ER în celulele din suspensia de orez (Fig. 2a) și, în aceste condiții, Gas2 a fost reglementat în jos ( Fig. 2b). În plus față de stresul ER, Gas2 a fost, de asemenea, reglat în jos sub diferite tensiuni abiotice, cum ar fi stresul rece (Fig. 2c), osmotic (Fig. 2d) și sare (Fig. 2e).
( la ) DTT a indus expresia OsbZIP50 în linii celulare de tip sălbatic și OsGas2 RNAi. Protoplastele au fost preparate din celule în suspensie și tratate cu 6,4 mM DTT timp de 18 ore la 26-28 ° C. ( ) Exprimarea OsGAS2 în protoplastele celulelor în suspensie cu tratamentul DTT 6,4 mM pentru momente diferite. ( c - e ) Exprimarea OsGAS2 în rădăcinile răsadurilor de 8 zile cu tratamentul la 4 ° C ( c ), 150 mM NaCI ( d ) și 40% din PEG 6000 ( și ) pentru momente diferite. ARN total a fost izolat pentru RT-PCR și experimentele au fost repetate de trei ori.
Imagine la dimensiune completă
Localizarea subcelulară
Deoarece Gas2 formează un complex proteic legat de caspază-3 cu GRP94 și HSP40 care conțin TPR, a fost examinată localizarea subcelulară a acestor trei proteine. Așa cum era de așteptat, Gas2 și GRP94 au fost localizate în ER (Fig. 3a, b), în timp ce HSP40 conținând TPR a fost localizat în citoplasmă (Fig. 3c). Deoarece activitatea citpazei-3 a fost prezentă în citoplasmă, acest lucru a sugerat că, în condiții specifice de stres, HSP40 care conține TPR poate forma un complex cu Gas2 și GRP94 la interfața citoplasmei ER, deoarece se știe că ER oferă situri de legare multe proteine citosolice.
Construcțiile care poartă 35S: Grp94-GFP, 35S: GAS2-GFP și 35S: GFA2-GFP, au fost introduse respectiv în protoplaste din tulpinile răsadurilor de orez prin transformare mediată de PEG-calciu. Fluorescența GFP a fost observată după 16 ore de incubare cu un microscop confocal PerkinElmer UltraVIEW VoX. ER-Tracker ™ albastru-alb DPX (E12353) a fost utilizat ca control de localizare ER. Experimentele au fost repetate de cel puțin cinci ori. Bară = 5 μm.
Imagine la dimensiune completă
Reglarea în jos a autofagiei induse de Gas2 în celulele cu suspensie de orez
Imagine la dimensiune completă
Gas2 este un nou substrat pentru activitatea caspazei-3 în orez.
( la ) Eticheta sa 6 a fost fuzionată în capătul N-terminal al OsGAS2 și mutantul D110A/D113A, iar proteina de fuziune a fost exprimată în E. coli. Proteinele mutante purificate de tip sălbatic și 6 marcate cu His au fost incubate respectiv cu tampon de reacție, caspază-3 și facțiune citosolică a celulelor de suspensie de orez tratate termic. După incubare, produsele de reacție au fost analizate cu 12,5% SDS-PAGE, urmat de imunoblotare cu un anticorp anti-poli histidină care a recunoscut epitopul OsGAS2 N-terminal marcat cu His 6. Săgețile indică benzile proteice țintă. ( ) Schema pentru fragmentarea OsGas2 de către caspase-3. OSGas2 de lungime completă cu un MW de 74 KDa este ilustrat ca o moleculă liniară cu un site de clivaj supus caspazei-3 DEYD 113, care este indicat de o săgeată. Digestia Caspase-3 a produs un fragment N-terminal cu un MW de 14 KDa (N) și un fragment C-terminal cu un MW de 60 KDa ( C ).
Imagine la dimensiune completă
Produsul de scindare a activității de tip caspază-3 amplificată de gaz2 în protoplastele de orez
Pentru a identifica funcția posibilă a produselor de scindare Gas2, fragmentele Gas2 N și C au fost exprimate în protoplastele mezofilelor de orez folosind un vector de expresie condiționată indusă de Dex, iar expresia fragmentului indusă în mod eficient de Dex (Fig. 6a). Comparativ cu expresia fragmentului N și controlul vectorului, expresia fragmentului C a dus la o creștere semnificativă a activității asemănătoare caspazei-3 după tratamentul termic (Fig. 6b). Interesant este că autofagozomii nu au fost detectați în protoplastele care exprimă cele două fragmente după tratamentul TDT (datele nu sunt prezentate).
( la ) Analiza RT-PCR a expresiilor fragmentului N-terminal (N) și fragmentului C-terminal (C) în protoplastele mezofile. ARN-ul total a fost preparat din protoplaste cu sau fără tratament Dex (control) timp de 18 ore. ARN 17S a fost utilizat ca control de încărcare. ( ) Activitate asemănătoare caspazei-3 în protoplastele mezofile sub expresia fragmentului N-terminal (N) și a fragmentului C-terminal (C). Expresia N și C a fost indusă de Dex timp de 18 ore, iar apoi protoplastele au fost tratate la 48 ° C timp de 15 minute și lăsate să se recupereze la 28 ° C timp de 6 ore. Protoplastul cu vectorul de expresie condițional gol a fost folosit ca control. Un număr egal de fracții citosolice au fost incubate cu Ac-DEVD-AMC, iar fluorescența AMC a fost măsurată în 60 de minute de un microprocesor la 30 ° C. RFU/mg: unități relative de fluorescență per mg de proteină.
Imagine la dimensiune completă
Discuţie
⊥: calea de inhibare care a fost demonstrată în acest document; săgeată solidă: cale de activare, translocare sau degradare care a fost demonstrată în acest document; săgeată de bord: calea care nu a fost studiată în acest document; cerc circular: enzima putoasă de tip caspază-3. Vezi textul pentru detalii.