STUDIU DE TOXICITATE COMBINATĂ A AFLATOXINEI B1 TOXICITATE COMBINATĂ A AFLATOXINEI B1 ȘI OCHRATOXIN
STUDIUL TOXICITĂȚII COMBINATE ALE MODELELOR DE AFLATOXINA B1 ȘI OCRATOXINEI A IN IN VITRO ȘI ÎN VIVO TOXICITATE COMBINATĂ A MODELELOR DE AFLATOXIN B1 ȘI OCHRATOXIN A IN IN VITRO ȘI ÎN MODURILE VIVO Laura Ana Corcuera Martínez TEZĂ DE DOCTORAT
Lucrarea de cercetare intitulată: STUDIUL TOXICITĂȚII COMBINATE A AFLATOXINEI B1 ȘI OCRATOXINEI A IN MODELURI IN VITRO ȘI IN VIVO TOXICITATE COMBINATĂ A AFLATOXINEI B1 ȘI OCHRATOXIN A IN MODELURI VITRO ȘI IN VIVO prezentate de doamna Laura Ana Corcuera Martínez pentru doctorand aspirant Universitatea din Navarra, a fost desfășurată în cadrul Departamentului de Științe Alimentare, Fiziologie și Toxicologie sub conducerea Dr. Adela López de Cerain Salsamendi și co-direcția Dr. Elena González-Peñas Pamplona, aprilie 2012 Dra. Adela López de Cerain Salsamendi Dra. Elena González-Peñas
Această lucrare a fost finanțată prin proiectele: Micotoxine: toxicitatea tratamentului combinat al ochratoxinei A și aflatoxinei B1 în modele in vitro și in vivo Ministerul Științei și Inovării al Guvernului Spaniei Referință: AGL2008-01437/ALI Prezența toxinelor în hrana și implicarea sa în sănătatea umană Fundația CAN Referință: 10829
Pentru familia mea din Pamplona, Begoña, Miguel, Lander, Javier, Jose, Asier, Txikitin, María, Manolo. pentru că m-a primit cu atâta afecțiune și m-a făcut să mă simt ca acasă. Lui Iban, pentru că a făcut fiecare pas cu mine pe această cale, pentru că mă ridic când cad și pentru răbdarea ta. Îți mulțumesc că mă iubești atât de mult și mă înțelegi atât de bine. Această teză este și a ta, iar viitorul este al nostru. Pentru familia mea, pentru că țin la mine. Ama, Bunica și Bunicul care au văzut începutul și din cer văd sfârșitul. Al Yayo, care se poate bucura de acest triumf cu mine. Pentru unchii mei Ignacio și Begoña, pentru María. Fratele meu Luis, vă mulțumesc pentru încurajare, curiozitate și admirație, mă faceți să vreau să fiu mai bună în fiecare zi. Nimic nu ar fi fost posibil fără părinții mei, stâlpii vieții mele. Vă mulțumesc că m-ați învățat că munca bine făcută este succesul în sine. Mulțumesc pentru dragostea ta, pentru că ai crezut în mine și mi-ai spus că aș putea. Acesta este și premiul tău. MULȚUMIRI TUTUROR! 9
Părinții mei A Iban Au primit-o pentru că nu știau că este imposibil Jean Cocteau
Abrevieri/Abrevieri ABREVIERI/ABREVIERI 3-ADON: 3-acetildeoxinivalenol/3-acetildeoxinivalenol 8-oxo-dG: 8-oxoguanină/8-oxoguanină 15-ADON: 15-acetildeoxinivalenol/15-acetildeoxinivalenol/Afen1Ben1 AFB1-formamidopirimidină/AFB1-formamidopirimidină AFB2: Aflatoxină B2/Aflatoxină B2 AFBO: AFB1-exo-8,9-epoxid/AFB1-exo-8,9-epoxid AFG1: Aflatoxină G1/Aflatoxină G1 AFG2: Aflatoxin G1 AFG2 G2 AEFI: Asociația spaniolă a produselor farmaceutice din industrie AOAC: Asociația Internațională a Chimiștilor Analitici/Asociația Chimiștilor Analitici Oficiali Sit AP: sit apirimidinic sau apurinic AU: Unități arbitrare greutate corporală: greutate corporală CIT: Citrinina/Citrinin CV: Coeficient de variație DCFH - DA: Dihidrodiclorofluoresceină diacetat/Dihidrodiclorofluoresceină diacetat DL 50: Doză letală 50 DON: Deoxinivalenol/Deoxinivalenol DTI: Aport zilnic tolerabil CE: Comisia Europeană/Comisia Europeană EFSA: Autoritatea Europeană de Siguranță Alimentaria/Autoritatea Europeană pentru Siguranța Alimentară 13
Abrevieri/Abrevieri OECD: Organizație pentru Cooperare și Dezvoltare Economică/Organizație pentru Cooperare și Dezvoltare Economică OTA: Ocratoxină A/Ocratoxină A PBS: tampon fosfat/tampon fosfat pc salină: greutate corporală PECE: extract de cacao îmbogățit cu polifenol/polifenol -extract de cacao îmbogățit pk a: constantă de disociere a acidului RE: eroare relativă SCF: Comitetul științific pentru alimentația Comisiei Europene/Comitetul științific pentru alimente SCOOP: Cooperarea științifică în problemele alimentare/Cooperarea științifică în problemele legate de alimente) RF: fluorescența relativă ROS: Specii de oxigen reactiv/Specii de oxigen reactiv RSD: Abatere standard/Abatere standard relativă SE: Eroare standard t 1/2: Timp de înjumătățire plasmatică eliminat/Timp de înjumătățire plasmatică T-2: Toxină T-2/T-2 toxină TWI: Consum săptămânal tolerabil UA: Unități arbitrare UHPLC-LD: Ultra cromatografie re lichidă foarte ridicată soluție cu detector de ultraviolete/detector de cromatografie lichidă ultra-performantă - detector de fluorescență UV: detector de ultraviolete OMS: Organizația Mondială a Sănătății/Organizația Mondială a Sănătății ZEA: Zearalenonă/Zearalenonă
CUPRINS/CUPRINS Capitolul 1/Capitolul 1 Introducere generală/generală Introducere 17 Capitolul 2 Scop, obiective și schiță 55 Capitolul 3 Ocratoxina A reduce deteriorarea ADN indusă de aflatoxina B1 detectată prin testul cometei în celulele Hep G2 61 Capitolul 4 Un extract de cacao îmbogățit cu polifenol reduce radicalii liberi produși de micotoxine 85 Capitolul 5 Validarea unei metode analitice UHPLC-FLD pentru cuantificarea simultană a aflatoxinei B1 și ochratoxinei A în plasma de șobolan, ficat și rinichi 109 Capitolul 6 O abordare a toxicității și toxicocineticii aflatoxinei B1 și ochratoxinei A după administrarea orală simultană la șobolani F344 135 Capitolul 7 Ocratoxina A reduce genotoxicitatea aflatoxinei B1: Aplicarea simultană a micronucleului in vivo și analiza cometei 159 Capitolul 8 Discuție generală 187 Capitolul 9/Capitolul 9 Concluzii/Concluzii 207 17
Capitolul 1/Capitolul 1 Introducere generală/Introducere generală
Capitolul 1/Capitolul 1 AFLATOXINA B1 Proprietăți chimice AFB1 aparține familiei cumarinei difuranice. Nomenclatura sa sistematică este 2,3,6aα, 9aα-tetrahidro-4-metoxiciclopenta [c] -b-furo [2 ', 3': 4,5] furo [2,3-h] cromene-1,11-dione, C 17H 12O 6 este formula sa moleculară și greutatea sa este de 312,27 g/mol. Variații ușoare ale structurii sale chimice dau naștere la setul de aflatoxine care pot fi găsite în natură (AFB1, AFB2, AFG1 și AFG2). AFB1 este cel cu cea mai mare concentrație, urmat de AFG1, AFB2 și AFG2. Ordinea pe care o urmează aceste substanțe în ceea ce privește toxicitatea acută și cronică este AFB1> AFG1> AFB2> AFG2 și este direct legată de capacitatea de a forma un epoxid la dubla legătură 8-9 (marcată cu o săgeată roșie în figură) și potența asociată cu ciclopentenone inele (săgeată albastră) (McLean și Dutton, 1995). Aflatoxinele M1 și M2 sunt produșii de hidroxilare ai metabolismului oxidativ al aflatoxinelor B1 și, respectiv, B2. Figura 1: Aflatoxine prezente în natură (EFSA, 2007) 24
Introducere generală/Introducere generală care induce formarea de 8-OHdG în ficatul de șobolan și rață. Această deteriorare a ADN-ului poate induce transversia G> T, ceea ce ar duce la o contribuție la carcinogenitatea AFB1 (Bedard și Massey, 2006). Figura 4: Evoluția aductului ADB-AFB1 (Smela și colab., 2002) 31
Capitolul 1/Capitolul 1 că OTA în forma sa fenolică (OTA -) este transformată într-un cation fenoxoniu (figura 8, J) care la rândul său se transformă în OTAQ (figura 8, K) (Ringot și colab., 2006; Dai și colab. al., 2002). Pe de altă parte, administrarea repetată de OTA este capabilă să reducă semnificativ nivelurile de antioxidanți intracelulari precum glutation (GSH), superoxid dismutază (SOD), catalază (CAT) sau glutation peroxidază (GSPx) în ficat și rinichi (Meki și Hussein, 2001) și crește peroxidarea lipidelor (Khan și colab., 1989). Studiile de structură-activitate au postulat că atomul de clor este esențial pentru efectul genotoxic al OTA, deoarece compușii clorurați care induc deteriorarea ADN-ului, suferă un proces de bioactivare la benzoquinone în prealabil (Ringot și colab., 2006). Figura 8: Formarea ROS de către OTA (Ringot și colab., 2006) Studiile privind expresia genelor au arătat că OTA este capabilă să reducă expresia genelor implicate în protecția oxidativă intracelulară mai intens în ficat decât în rinichi (Cavin și colab., 2007; Arbillaga și colab., 2008); și care crește expresia oxidului de azot sintetază 40