Mir-146a-5p suprimă activarea și proliferarea celulelor stelate hepatice în

activarea

  • Subiecte
  • rezumat
  • Introducere
  • Rezultate
  • Expresia diferențială a miARN-urilor hepatice la șoareci cu steatohepatită fibroasă
  • Analiza ontologiei genei bazată pe microarray și analiza căilor pentru miARN exprimate diferențial
  • Validarea expresiei miARN prin PCR cantitativă în timp real (qRT-PCR)
  • miR-146a-5p a fost reglat în jos în HSC-uri activate in vitro
  • Supraexpresia MiR-146a-5p a suprimat proliferarea HSC
  • Efectele miR-146a-4p asupra activării HSC și depunerii de colagen
  • miR-146a-5p a acționat direct asupra 3'UTR al mRNA Wnt1 și Wnt5a
  • miR-146a-5p reglează negativ Wnt1 și Wnt5a la nivel posttranscripțional
  • Efectele supraexprimării și inhibării miR-146a-5p asupra genelor țintă în aval de calea de semnalizare Wnt
  • Scăderea Wnt1 sau Wnt5a a inhibat expresia genică a semnalizării Wnt în aval și a fibrogenezei
  • Discuţie
  • Metode
  • Modele animale de steatohepatită fibroasă nealcoolică
  • Analiza histologică și analiza biochimică.
  • MicroRNA Microarray Assay
  • Analiza QRT-PCR
  • Identificarea potențialelor ținte miARN
  • Izolarea, cultura și identificarea HSC
  • Transfecția MiR-146a-5p în HSC
  • Interferența și transfecția ARN
  • Analiza imunocitochimică.
  • Testul proliferării celulare
  • Analiza Western Blot
  • Luciferase Activity Assay
  • analiza statistică
  • informatii suplimentare
  • Informatie suplimentara
  • Fișiere PDF
  • Informatie suplimentara
  • Comentarii

Subiecte

  • Fibroza hepatică
  • Boală hepatică grasă nealcoolică

rezumat

Introducere

Steatohepatita nealcoolică (NASH) face parte din spectrul bolii hepatice grase nealcoolice (NAFLD), caracterizat prin steatoză, inflamație lobulară și fibroză pericelulară progresivă. Cu leziuni hepatice prelungite, steatohepatita poate evolua spre fibroză hepatică caracterizată prin acumularea excesivă de matrice extracelulară (ECM). Celulele stelate hepatice (HSC) joacă un rol central în patogeneza fibrozei hepatice 2. HSC-urile inactive pot deveni activate ca răspuns la steatohepatita cronică 3. HSC-urile activate stimulează producția de colagen și acumularea de ECM, rezultând apariția fibrozei hepatice 4. În ciuda progreselor fundamentale în înțelegerea fiziopatologiei steatohepatitei nealcoolice fibroase, mecanismele fibrogenezei în prezența steatohepatitei rămân evazive.

Rezultate

Expresia diferențială a miARN-urilor hepatice la șoareci cu steatohepatită fibroasă

Așa cum se arată în Fig. 1, secțiunile hepatice de la șoareci hrăniți cu o dietă MCD au prezentat o structură lobulară dezordonată, macrosteatoză în Zona 3, necroză hepatocitară punctuală sau focală, infiltrare inflamatorie și fibroză perisinusoidală (Fig. 1A), care a fost însoțită de ser semnificativ mai Nivelurile ALT și AST (P 2 ori) (Fig. 1C).

( LA ) Modificări histopatologice ale secțiunilor hepatice la șoareci care au alimentat dieta și controlul MCD. Hematoxilină și eozină colorate (în partea de sus) și tricromatismul lui Masson colorate (în partea de jos). ( ) Efectul dietei MCD asupra nivelurilor serice de ALT și AST. ( C ) MiARN-uri reglementate diferențial, identificate de microarrays-uri de miARN. ( D ) Validarea datelor microarray folosind RT-PCR în timp real. Testele au fost efectuate în triplicat pentru fiecare probă de ARN și cantitatea relativă a fiecărui miARN a fost normalizată la U6 snARN. Valorile sunt medii ± SD, ** P

( LA ) Analiza categoriei GO bazată pe obiectivele prezise ale tuturor miARN-urilor reglementate diferențial. Axa verticală reprezintă categoria GO, iar axa orizontală reprezintă îmbogățirea GO. ( ) Analiza căii pentru miARN reglementate diferențial. Sunt afișate numai traseele cu P

( LA ) Imagini reprezentative morfologice și colorare imunocitochimică a HSC-urilor în repaus și activate pentru desmin și α-SMA (400 ×). ( ) expresia miR-146a-5p a fost examinată prin qRT-PCR în timp real. Valorile sunt medii ± SD, ** P # P

( LA ) Colorarea Desmin care indică proliferarea celulelor LX-2 și HSC-T6 este scăzută atunci când miR-146a-5p este supraexprimat. ( ) miR-146a-5p a inhibat creșterea celulelor LX-2 și HSC-T6 determinate de testele CCK-8. Valorile sunt medii ± SD, * P

( LA, C ) site-uri potențiale de legare ale miR-146a-5p în 3'UTR al Wnt1 și Wnt5a. ( , D ) Celulele HEK-293T au fost transfectate cu un vector reporter de luciferază care conține forma 3'UTR de tip sălbatic sau mutant de Wnt1 și Wnt5a, în prezența mimicilor miR-146a-5p, control mimic, inhibitor miR-146a -5p și control inhibitor, și apoi evaluat pentru activitatea reporterului de luciferază la 48 de ore după transfecție. Valorile sunt medii ± SD, * P # P # P ## P

( LA ) nivelurile de ARNm și proteine ​​( ) de β-catenină, GSK-3β și NFAT5 la șoareci hrăniți cu ficat cu dietă MCD și martori. ( C ) HSC-T6 au fost transfectate cu inhibitor miR-146a-5p sau control inhibitor, mimice miR-146a-5p sau control mimic timp de 48 de ore. Nivelurile de ARNm și proteine ​​( D ) de β-catenină, GSK-3β și NFAT5 au fost analizate prin RT-PCR în timp real și respectiv Western blot. Β-actina a fost utilizată ca control al încărcării. Valorile sunt medii ± SD, ** P