Imagistica neinvazivă a candidozei diseminate în protocolul larvelor de pește zebră (tradus în

rezumat

Dezvoltarea rapidă a dimensiunilor mici și transparența peștelui zebră sunt avantaje mari pentru studiul controlului imun înnăscut al infecției 1-4. Aici ni se arată tehnici de infectare a larvelor de pește zebră cu ciuperca patogenă Candida albicans Prin microinjecție, metodologia utilizată recent pentru a implica activitatea fagocitelor NADPH oxidază în controlul dimorfismului fungic 5 .

Abstract

Candidoza diseminată cauzată de agentul patogen Candida albicans este o problemă importantă clinic la indivizii spitalizați și este asociată cu o mortalitate atribuibilă de 30-40% 6. Candidoza sistemică este în mod normal controlată de imunitate înnăscută, iar persoanele cu defecte genetice ale componentelor celulelor imune înnăscute precum NADPH oxidaza fagocitară sunt mai susceptibile la candidemia 7-9. Se știe foarte puțin despre dinamica interacțiunii C. albicans cu celulele imune in vivo. Studii extinse in vitro au arătat că în afara gazdei C. albicans germinează în macrofage și este rapid distrusă de neutrofilele 10-14. Studiile in vitro, deși utile, nu pot rezuma complexul într-un mediu de viață, care include dinamica dependentă de timp a nivelurilor de citokine, atașamentele matricei extracelulare și contactele intercelulare 10, 15-18. Pentru a investiga contribuția acestor factori în interacțiunea gazdă-agent patogen, este esențial să se găsească un organism model care să vizualizeze aceste aspecte ale infecției neinvaziv într-o gazdă vie intactă.

Larvele Zebrafish oferă o gazdă vertebrată unică și versatilă pentru studiul infecției. În primele 30 de zile de dezvoltare, larvele de pește zebră au doar apărări imune înnăscute 2, 19-21, ceea ce simplifică studiul unor boli precum candidoză diseminată care sunt extrem de dependente de imunitatea înnăscută. Dimensiunea redusă și transparența larvelor de pește zebră vor permite imagistica dinamicii infecției la nivel celular, atât pentru gazdă, cât și pentru agentul patogen. Celulele imune fluorescente larvare transgenice pot fi utilizate pentru a identifica tipurile specifice de celule implicate în infecția 22-24. Oligonucleotidele antisens modificate (Morpholinos) pot fi utilizate pentru a dărâma diverse componente imune, cum ar fi NADPH oxidaza fagocitară și pentru a studia modificările ca răspuns la infecția fungică 5. În plus față de avantajele practice și etice ale utilizării unui vertebrat inferior mic, larvele de pește posibilitate unică de a imagina bătălia intensă dintre agentul patogen și gazdă atât în ​​mod intravital, cât și în culori.

Peștele zebră a fost folosit pentru modelarea infecției pentru o serie de bacterii patogene umane și a fost esențial pentru progrese importante în înțelegerea infecției micobacteriene 3, 25. Cu toate acestea, doar recent, au fost utilizați agenți patogeni mult mai mari, cum ar fi ciupercile, pentru a infecta larvele 5, 23, 26 și până în prezent nu a existat nicio descriere vizuală detaliată a metodologiei infecției. Aici vă prezentăm tehnicile noastre de microinjecție a creierului posterior al ventriculului Prim 25, inclusiv modificările noastre ale protocoalelor anterioare. Rezultatele noastre cu modelul larvelor de pește zebră pentru infecția fungică diferă de studiile in vitro și consolidează necesitatea examinării interacțiunii gazdă-agent patogen în mediul complex al mașinii, mai degrabă decât sistemul simplificat al cutiei Petri 5.

Protocol

Toate protocoalele și experimentele de îngrijire a peștilor zebră au fost efectuate în conformitate cu protocolul instituțional de îngrijire și angajare a animalelor (IACUC) A2009-11-01.

1. Morpholino și vasele larvare de injecție

Durata experimentală: * (10-15 minute)

Gradul de dificultate: *

  1. Pentru injecții cu ouă, preparați o soluție de 2% de agaroză în apă sterilă și cuptor cu microunde. Când soluția s-a răcit, se toarnă o parte dintr-o cutie Petri foarte adâncă (Fisher Scientific) până când este pe jumătate plină. Se răcește în gheață și se nivelează placa.
  2. Odată ce placa s-a răcit, se toarnă un strat superior de 15 ml de agaroză 2%. Pulverizați o matriță de injecție cu ouă din plastic (Instrumente adaptive ale științei) cu apă sterilă dintr-o sticlă de pulverizare. Așezați cu grijă partea fantă în jos în matrița fierbinte de agaroză. Când agaroza s-a răcit, utilizați o spatulă metalică plană (VWR Scientific) pentru a disocia șablonul de AGA ridicat. Scoateți treptat grila din agaroză. Înfășurați vasele pentru injecția embrionilor în Parafilm (VWR Scientific) și depozitați inversat la 4 ° C.
  3. Pentru injecțiile cu larve de pește, preparați o soluție de agaroză 2% așa cum este descris. Se toarnă soluția într-o cutie Petri de dimensiuni standard (VWR Scientific) și se lasă deoparte până se solidifică. Înfășurați plăci de larve de injecție Parafilm și cort inversat la 4 ° C.

2. Pregătirea culturii ciupercilor

Durata experimentală: ** (30 minute)

Gradul de dificultate: **

3. Infecții cu pește zebră

Durata experimentală: **** (1-3 ore)

Gradul de dificultate: ****

4. Pregătirea peștelui din imagine

Durata experimentală: ** (30 minute)

Gradul de dificultate: **

  1. Se prepară soluție de tricaină metan sulfonat ca înainte (200 mg/ml). Scoateți peștele infectat și transferați-l în tricaină.
  2. Se prepară 47,9 ml 0,4% agaroză cu punct de topire scăzut (VWR Scientific) în ou și apă. Încălziți soluția în cuptorul cu microunde. Se răcește la 37 ° C și se adaugă metan sulfonat de tricaină (200 mg/ml) la amestecul de
  3. Odată ce peștii sunt imobilizați în metan sulfonat de tricaină, pipetați peștii individuali într-o cutie Petri (VWR Scientific) conținând 0,4% agaroză cu topire redusă (VWR Scientific).
  4. Apoi, schimbați peștele de agaroză cu topire scăzută în puțurile individuale ale unei plăci de fund din sticlă (MatTek Corporation) pentru imagistică. Utilizați cât mai puțină agaroză cu topire redusă pentru ca peștele să se întindă pe fundul capsulei. Folosiți suficient din tricaină-agaroză pentru a umple cercurile interioare de pe placa de sticlă.