Efectul relației enzimă-substrat asupra hidrolizei enzimatice a zerului bovin de Alcalasa®

Efectul relației enzimă-substrat asupra hidrolizei enzimatice a zerului bovin de Alcalasa® 2.4L

Omar A. Figueroa 1

2. Sandy P. Peñaloza

1 Facultatea de Inginerie, Departamentul de Inginerie Agroindustrială, Universidad de la Guajira, Km 5 Vía Maicao, Riohacha, -Colombia. (e-mail: [email protected])

2 Facultatea de Inginerie, Departamentul de Inginerie Agroindustrială, Univ. Popular del Cesar, Diagonal 21 Nr. 29-56 Valledupar-Columbia. (e-mail: [email protected]; [email protected])

3 Facultatea de Științe Farmaceutice și Alimentare, Departamentul Alimentar, Univ. De Antioquia, Calle 70 # 52-21, Apartado Aéro 1226, Medellín, Columbia. (e-mail: [email protected])

Obiectivul acestui studiu a fost de a analiza capacitatea antioxidantă (măsurată cu FRAP și ABTS) și potențialul de chelatare a fierului în timp în diferite condiții de enzimă și substrat. Hidroliza enzimatică a zerului praf bovin a fost efectuată într-un reactor discontinuu cu o capacitate de 0,5 L și o temperatură constantă. Hidrolizatele cu cea mai mare activitate au fost separate în funcție de mărimea lor moleculară la un raport de> 100, 10-100, + este scăzut. Creșterea gradului de hidroliză favorizează activitatea antioxidantă măsurată prin metoda ABTS, precum și activitatea de chelatare a fierului a hidrolizatelor.

Cuvinte cheie: hidroliza enzimatică; zer; alcalase; proteine; peptide antioxidante

Obiectivul principal al acestui studiu a fost de a analiza capacitatea antioxidantă (măsurată cu FRAP și ABTS) și potențialul chelator al fierului în timp în diferite condiții de enzimă și substrat. Hidroliza enzimatică a pulberii din zer bovin a fost efectuată într-un reactor discontinuu cu o capacitate de 0,5 L și temperatură constantă. Cele mai active hidrolizate au fost separate în funcție de mărimea lor moleculară la o rată de> 100, 10-100, cationii + sunt scăzute la substraturi mici. Creșterea gradului de hidroliză favorizează activitatea antioxidantă măsurată prin metoda ABTS și activitatea de chelare a metalelor hidrolizate.

Cuvinte cheie: hidroliza enzimatică; proteine din zer; alcalase; proteine; peptide antioxidante

Diferite studii au stabilit relația dintre activitatea biologică a peptidelor și greutatea moleculară a acestora. În special, fracțiunile peptidice cu greutăți moleculare între 1 - 4kDa, ar fi cele mai interesante pentru utilizări nutriționale și/sau farmaceutice (Saidi și colab., 2014). Atât ultra cât și nanofiltrarea sunt tehnologii utilizate cu relativ succes pentru purificarea peptidelor cu efecte bioactive din proteinele din lapte hidrolizate, soia și substraturile vegetale (De Castro și Sato, 2015). Reacția de hidroliză enzimatică a proteinelor are o mare complexitate în principal datorită: i) naturii variate și adesea necunoscute a substraturilor (structuri primare și terțiare ale diferitelor proteine), ii) formării de noi substraturi de hidroliză pe măsură ce reacția progresează, iii) eliberarea de peptide scurte și aminoacizi liberi provocând inhibiții grave. iv) inactivarea enzimei în timp (Valencia și colab., 2015) și v) efecte asociate cu reactivitatea variată a legăturilor în raport cu enzima utilizată, precum și accesibilitatea acestora la situsuri de reacție specifice (structura terțiară și cuaternară) de proteine) (Fernández și Riera, 2013).

MATERIALE ȘI METODE

În continuare, sunt descrise elemente legate de controalele sistemelor de reacție, metodele analitice utilizate și proiectarea experimentelor utilizate.

Sistem de reacție

Hidroliza a fost efectuată într-un reactor de sticlă cu capacitate de 0,5 L, cu o manta de circulație a apei pentru reglarea temperaturii, conectată la o baie de circulație cu un regulator termostatic MX07R-20 (Thomas Scientific, SUA ± 0,07 ° C). Pentru a controla pH-ul și a înregistra temperatura reacției, a fost utilizat un electrod de sticlă combinat cu o diafragmă fixă la sol, conectat la un titrator automat Titrando 842 (Metrohm, Elveția), acționat de computer (software Tiamo 1.2.1), așa cum se arată în Fig. 1. Mediul de reacție a fost agitat constant folosind un agitator magnetic 801 (Metrohm, Elveția) cu o viteză de 400 rpm. Temperatura și pH-ul din sistem au fost menținute constante cu valori de 61 ° C și respectiv 9.

S-a folosit zer pulverizat din lapte de bovine, achiziționat de la un furnizor comercial din orașul Bogotá-Columbia, cu un conținut de proteine declarat de 12%. Aceste date au fost coroborate prin metoda Kjeldahl (AOAC 2005, 954.01), folosind 6,38 ca factor de conversie pentru a estima conținutul de proteine. Enzima corespunde unei endoproteaze din Bacillus licheniformis din preparatul comercial Alcalasa ® 2,4 L (2,4 AU-A/g) de calitate alimentară (Novozymes, Danemarca).

Fig. 1. Schema sistemului de reacție de hidroliză utilizat în experiment.

Procesul de hidroliză enzimatică

Reacția a fost efectuată prin intermediul hidrolizei enzimatice controlată cu metoda pH-stat, recunoscută ca fiind cea mai utilizată în hidroliza enzimatică datorită simplității sale (Rutherfurd, 2010), care constă în menținerea pH-ului constant prin adăugarea de bază sau acid diluat. În acest caz, întrucât este o reacție alcalină, s-a folosit NaOH 1 M. În principiu, baza adăugată pentru a menține pH-ul constant, neutralizează doar protonii eliberați în timpul descompunerii legăturii amidice a proteinelor și peptidelor la pH alcalin, care sunt înlocuite cu cationul bazei; astfel protonii generați prin hidroliză sunt echivalenți cu moli ai bazei adăugate (Adler-Nissen, 1986). Estimarea GH a fost făcută folosind ecuația (1).

Unde: h = Numărul de legături peptidice hidrolizate; Htot = Numărul total de legături peptidice în substratul proteic (eq/Kg); VNaOH = Volumul NaOH total (L), Nb = Normalitatea bazei, Mp = masa proteinei (în kg), GH = gradul de hidroliză.

Gradul de disociere a grupărilor α-NH2 eliberate în reacție, α, este calculat direct din ecuația (2) și depinde de pH-ul de lucru și pK. Acesta din urmă variază semnificativ în funcție de temperatura de reacție și poate fi estimat conform ecuației (3) (Salazar și colab., 2012). S-a folosit un α calculat de 0,992 și un htot de 8,8 meq/g care a fost raportat pentru proteinele din zer (Adler-Nissen, 1986).

Unde: α = Gradul de disociere a proteinei și T = temperatura de lucru în grade Kelvin.

Descrierea proiectului

În analiză, influența E0 (150, 300 și 600 mg/L) și S0 (5.10, 10.20 și 20.40 g/L) a fost verificată prin timpul de reacție (0-120 min), asupra capacității antioxidante in-vitro (ABTS și FRAP) și capacitatea de chelatare a fierului (CQFe). O analiză comparativă a evoluției diferitelor variabile dependente a fost efectuată în două grupe de experimente: A) variază S0 și menține constant E0; B) menținerea S0 constantă și variabilă E0, așa cum se indică în Tabelul 1. Nivelurile de concentrație ale substratului coincid cu regiunea apropiată de valoarea Km, unde rata inițială de hidroliză este considerabilă, în curba de saturație. În timp ce nivelurile de enzime utilizate au fost definite de testele anterioare nepublicate. În analiză, a fost utilizat un ANOVA pentru măsuri repetate cu un factor intra-subiect (timp: 0, 10, 20,75 și 120 min) și un factor inter-subiect (S0 sau E0 pentru fiecare experiment), cu un nivel de semnificație statistică de 0,05. Fiecare hidroliză în condițiile stabilite de proiectare a fost efectuată în trei exemplare.