Detectarea paratuberculozei Mycobacterium avium la capre situate într-o zonă semi-aridă în zona
A fost utilizată o tulpină de câmp de Mycobacterium avium paratuberculosis, donată de Dr. Marco Antonio Santillán de la CENID Microbiology INIFAP, această tulpină a fost utilizată ca control pozitiv în testul PCR.
La sfârșitul anului 2008, 139 de probe de fecale și sânge au fost colectate de la capre între 1 și 3,5 ani în comunitatea La Mesilla, din municipiul Tecozautla. Acest municipiu este situat în statul Hidalgo, între paralelele 20 ° 48 'de latitudine, -99 ° 67' longitudine, la o altitudine de 1.890 metri deasupra nivelului mării. În această zonă există producători de tip rural cu producții cu un nivel scăzut de tehnificare, cu puține practici de medicină preventivă, iar producția de capre este extinsă. Au lucrat cu 8 efective diferite, toți suspecți la Map. Fecalele au fost plasate în pungi și probele de sânge în tuburi de vid fără anticoagulant. După ce au fost colectate, probele au fost plasate într-un termos cu gheață pentru conservarea lor și analiza ulterioară în Laboratorul de Microbiologie Agricolă al Unității Universidad Autónoma Metropolitana Xochimilco.
Pata Ziehl-Neelsen (ZN)
Toate probele de scaun au fost analizate folosind pata specială acid-alcool-rapidă (17), care relevă practic prezența bacililor rezistenți la acid-alcool, compatibili cu Map.
Extracția ADN din probele de scaun
PCR imbricat pentru detectarea hărților
Pentru prima amplificare, s-au folosit grundii externi IS 900-F (5 'TGATCTGGA CAATGACGGTTACGGA 3') și IS 900-R (5 'CGCGGCACGGCTCTTGTT 3'), care amplifică un produs de 563 pb (18). Reacția PCR conținea: 45 pl de amestec PCR (22mM Tris-HCI pH 8,4, 1,65 mM MgCl 2, 220 uM dGTP, 220 dATP, 220 uM dCTP, 220 uM dTTP, 2 U de Taq polimerază (Promega) 300 pM din prima IS900-F, 300 pM din primul IS900-R și 2 pl de probă de ADN. Condițiile ciclurilor PCR au fost: denaturarea inițială de 94 ° C timp de 3 minute, urmată de 35 de cicluri de 94 ° C timp de 1 minut, 56 ° C timp de 1 minut și 72 ° C timp de 1 minut Pentru a doua amplificare (PCR imbricată), 5 µl din produsul amplificat au fost preluați și adăugați la o nouă reacție PCR, acum cu grundii interni IS 900 -IF (5 'GCCGCGCTGCTGGAGTTGA 3 ') și IS 900-IR (5' AGCGTCTTTGGCGTCGGTCTTG 3 '), care generează un produs de 210 bp, condițiile acestui ciclu PCR au fost aceleași. Produsele obținute din această a doua amplificare au fost vizualizate prin electroforeză pe geluri de agaroză 1% colorate în bromură de etidiu (18).
Au fost folosite numai seruri de la animale aparținând efectivului cu amplificări pozitive pentru Hartă. Un sistem comercial „Paratuberculosis Screening Ab kit” (IDEXX Laboratories, Inc., Westbrook, ME) (19) a fost utilizat, urmând specificațiile producătorului, pentru a realiza tehnica.
Extracția ADN din probele de scaun
Procedura de extracție și vizualizare a ADN a fost efectuată pe cele 139 de probe. Dintre aceste probe, doar 54 au avut o prezență clară de ADN. În (Figura 1) se observă ADN-ul extras din unele eșantioane, așa cum se poate observa în această figură, ADN-ul obținut prezintă o ușoară degradare, care nu a afectat dezvoltarea tehnicii PCR, a fost, de asemenea, posibil să se aprecieze în unele probe prezența ARN-ului, care este normal având în vedere protocolul de extracție utilizat.
Pata Ziehl-Neelsen (ZN)
În analiza probelor prin colorare ZN, 6 din cele 139 de probe analizate au fost pozitive pentru colorare, adică bacili acid-alcool-rapide compatibili cu Harta (Figura 2, Tabelul 1). Pentru turma A, cele 4 probe pozitive reprezintă 20%, în timp ce pentru turma D s-au observat 4% din probele pozitive la colorare, iar în cele din urmă la turma H s-a obținut o probă pozitivă la colorare, care reprezintă 8,3% din turma totală.
Înainte de utilizarea sa cu probele, tehnica PCR a fost standardizată utilizând ADN dintr-o tulpină Map. Acest ADN a fost utilizat în toate analizele ca un control pozitiv. Dintre toate eșantioanele analizate, 7 au avut rezultate pozitive în PCR imbricată (Figura 3). Trebuie remarcat faptul că aceste 7 probe provin din turma A, coincizând cu trei probe pozitive pentru colorarea ZN și cinci pentru ELISA (Tabelul 1). Aceste șapte probe reprezintă 5,03% din totalul probelor; și 35% din totalul probelor din turma 1, unde a existat o frecvență mai mare a probelor pozitive pentru Harta .
Analiza serurilor prin ELISA
Doar serurile din efectivele pozitive ale hărții au fost analizate prin colorare PCR și ZN, rezultatele obținute sunt prezentate în tabelul 2, unde sunt incluse valorile de referință negative și pozitive. Folosind aceste date, a fost stabilit un punct limită de 0,438, așa cum a propus Kurstak (20). Având în vedere această valoare, mostrele A3, A18, A8, A11 și A16 au fost pozitive. În cazul probelor A11 și A18, rezultatele coincid cu cele obținute în testul PCR.
Paratuberculoza este o boală infecțioasă cu o distribuție la nivel mondial care afectează negativ producția de animale. În Mexic, situația privind incidența acestei boli este necunoscută și există puține raportări la rumegătoarele mici. În această lucrare, prezența Hărții este raportată într-o turmă de capre din Tecozautla, Hidalgo, fiind primul raport Harta din această zonă. Anterior Chávez și colab. (8) au efectuat o căutare a acestui microorganism folosind diferite metodologii într-o turmă de capre situată în Valea Mexicului. Această lucrare împreună cu cea anterioară constituie primele rapoarte ale Hărții la capre.
Au fost concepute diferite metodologii pentru a determina prezența unui agent infecțios într-o populație, în mod logic prima este izolarea; cu toate acestea, pentru multe microorganisme patogene, în special cele din genul Mycobacterium spp., izolarea este dificilă și reprezintă un risc, deoarece unele specii din acest gen sunt considerate zoonotice (10,18). În această lucrare, s-au folosit metode directe și indirecte; în primul caz, s-a decis utilizarea unei metode moleculare bazată pe tehnica PCR, care relevă prezența ADN-ului în probele clinice. Această metodă are și avantajul că, prin faptul că nu lucrează direct cu agentul, este o metodă sigură. Cu această metodologie, au fost identificate șapte probe pozitive, dintr-un total de 139. Probele pozitive au fost de la animale aparținând aceleiași turme, unde au fost studiate 20 de probe. Chávez și colab. (8) lucrând cu o singură turmă de 27 de animale, au reușit izolarea în 4 cazuri și au durat aproximativ 14 săptămâni; în cazul nostru, identificarea animalelor pozitive a necesitat doar două zile.