Codificare genetică a unui aminoacid necanonic pentru generarea conjugatelor de anticorpi-medicamente
rezumat
Încorporarea unui ciclopropen derivat din anticorp lizină permite legarea specifică, rapidă și eficientă a moleculelor purtătoare de tetrazină pentru a genera medicamente anticorp conjugate.
Abstract
Introducere
Conjugații anticorp-medicament (ADC) combină selectivitatea bioterapiei și potența moleculelor citotoxice mici. Majoritatea ADC pretind că scad efectele secundare ale chimioterapiei tradiționale prin țintirea medicamentelor care afectează polimerizarea ADN-ului sau a microtubulilor celulelor canceroase 1. ADC de prima generație aprobate de Food and Drug Administration (FDA) se bazează pe modificarea lizinelor și cisteinelor, care generează amestecuri de molecule modificate în diferite poziții cu proprietăți farmacocinetice scăzute 2. Dimpotrivă, conjugarea specifică a medicamentelor pentru anticorpi poate genera compuși cu indici terapeutici mai buni 3, 4. Încercând să facă față provocării de a produce ADC omogene, au fost raportate mai multe modificări chimice și enzimatice selective 1, 5. Cu toate acestea, metodele actuale pot viza doar o anumită poziție pe anticorp, pot suferi de o expresie scăzută a proteinelor, pot oferi linkeri cu stabilitate scăzută sau pot depinde de reacții lente și randament scăzut.
Incorporarea aminoacizilor necanonici (ncAA) prin extinderea codului genetic permite instalarea specifică a site-ului a unei multitudini de grupări bioortogonale reactive în proteine, depășind potențial limitările altor metode utilizate pentru a genera ADC. Codificarea ncAA ca răspuns la un codon țintă (stop) se bazează pe perechi de aminoacil-ARNt sintetază/ARNt care sunt ortogonale la perechi endogene care încorporează 6 aminoacizi canonici. Mai multe NcAA au fost încorporate în anticorpi pentru a genera ADC. Cu toate acestea, diverse datorii suferă mai mult pentru cererile de conjugare a medicamentelor terapeutice. p-acetilfenilalanina (pAcF) 7, 8 nu este total bioortogonală, necesită un pH scăzut (4,5) și timpi de reacție lungi (> 60 h), în timp ce azidele precum p-azidofenilalanina (pAzF) 7, 9, 10, p- azidometilfenilalanina (inversare) 11 și un derivat al azidei lizinei (AzK) 12, 13 pot fi reduse în celula 14, iar cuprul utilizat pentru a cataliza activitatea Huisgen poate induce daune oxidative 15 .
Deși ncAAs-ciclooctene alternative (TCO), ciclooctine (SCO) și biciclo [6.1.0] nonene (BCN) alternative pe bază de transport au fost recent codificate într-un anticorp în scopul bio-imagisticii, sistemul de expresie are randamente foarte mici (0,5 mg/L) 16. Pe de altă parte, ciclooctenele și ciclooctenele sunt mânere mari și hidrofobe care pot crește susceptibilitatea ADC la sarcini utile - ADC-urile de agregare sunt în mod tradițional hidrofobe, iar proprietățile fizico-chimice ale mașinii de mezeluri au demonstrat un indice de impact farmacocinetic și terapeutic ridicat 17 În schimb, ciclopropenele 1,3-disubstituite sunt grupuri reactive mici care ar trebui să provoace o modificare minimă a structurii proteinelor și a proprietăților fizico-chimice 18. Ciclopropenele reacționează selectiv și rapid cu tetrazinele printr-o cicloadiție Diels-Alder de cerere electronică inversă 19. În acest protocol folosim un derivat care poartă lizină (CypK, Figura 1b) un metil ciclopropen care este mai puțin afectat de obstacol steric decât inelele nesaturate filtrate mai mari și are o viteză de reacție constantă de ordinul 1-30 M -1 s -1 în mediu apos 18, 20 .
El ne-a informat recent cum să încorporăm CypK în anticorpi pentru a genera ADC prin reacția acestui arbore minim bioortogonal cu molecule purtătoare de tetrazină 21. Aici vom descrie procedura de pregătire ADC mai detaliat, cu accent pe pașii mai dificili. Incorporarea CypK este direcționată cu o pereche pirolizil-tRNA sintetază (PylRS)/tRNACUA (PylT) ca răspuns la un codon chihlimbar introdus în lanțul greu al anticorpului (HC) 22. Aici folosim două plasmide pentru transfecția tranzitorie (Figura 1a), codificând lanțul greu de anticorpi și celălalt codificând lanțul ușor (LC), ambele conținând caseta PylRS/PylT. Alternativ, o linie celulară stabilă care permite randamente mai mari de anticorp poate fi generată printr-o procedură mai laborioasă. .
Sistemele de expresie de mai sus pot produce imunoglobulina terapeutică anti-HER2 (IgG1) trastuzumab cu CypK la niveluri similare cu anticorpii de tip sălbatic. Am selectat prima poziție a domeniului CH1 al lanțului greu pentru a codifica ncAA (HC-118TAG). Acesta este cel mai frecvent modificat site din ADC-urile 23 și este cunoscut sub numele de HC-118 (enumerarea UE), dar a fost cunoscut și sub numele de HC-121 (poziția secvenței) și HC-114 (enumerarea Kabat) 24. Deoarece această poziție este conservată pe tot parcursul IgG1, aceste sisteme de expresie trebuie să fie susceptibile la anticorpii cei mai terapeutici.
Arătăm că trastuzumab (CypK) 2 poate fi purificat cu ușurință din proteina A, urmată de cromatografie rapidă pe lichid cu o coloană de interacțiune hidrofobă (HIC-FPLC). Ulterior, anticorpul este covalent în decurs de 3 ore față de inhibitorul de polimerizare a microtubulilor monometil auristatin E (MMAE), care este utilizat în ADCetris ADC aprobat de FDA. Aici utilizăm un derivat benzilic tetrazină MMAE (tetrazină-vcMMAE) cu un linker cuprinzând un distanțier glutarat și o componentă labilă protină valină-citrulină, urmată de o unitate auto-imolativă de p-aminobenzilalcool; Acest linker este scindat de catepsina B în lizozom la internalizarea ADC, rezultând eliberarea toxinei 25 fără a lăsa urme. Pentru a demonstra amploarea reacției, anticorpul este legat și de fluorofor tetrametilrodamină (TAMRA). Vă explicăm cum să verificați identitatea conjugatului prin cromatografie lichidă cuplată cu spectrometria de masă (LC-MS) și să calculăm raportul medicament-anticorp (DAR) prin cromatografie lichidă de înaltă performanță cu o coloană de interacțiune hidrofobă (HIC-HPLC) .