Caracterizarea profilului proteic al unei tulpini

Universitatea din Granada Institutul de Biotehnologie Lucrări de cercetare ghidate pentru obținerea titlului: Master în Biotehnologie Caracterizarea profilului proteic al unei tulpini entomopatogene de Bacillus pumilus. Diana Carolina García Ramón Iulie 2011 Tutor: Co-Tutor: Dra. Susana Vílchez Tornero Profesor angajat Doctor Departamentul de Biochimie Institutul de Biotehnologie Universitatea din Granada Dr. Antonio Osuna Carrillo de Albornoz Profesor al Universității din Granada Departamentul de Parazitologie Universitatea din Granada

O parte din rezultatele acestei lucrări de cercetare au fost prezentate la cea de-a 13-a reuniune europeană a Congresului grupurilor de lucru IOBC/WPRS, prin prezentare orală, cu titlul: Înțelegerea toxicității Bacillus pumilus 15.1 față de musca fructelor mediteraneene (Ceratitis capitata). Locul desfășurării: Innsbruck Austria Data: 19-23 iunie 2011

RECUNOAȘTERE DE INDICE. I INDEX. V REZUMAT. 1 ABREVIERI. 5 1. INTRODUCERE. 9 1.1 Microorganisme entomopatogene. 11 1.2 Bacterii entomopatogene. 13 1.2.1 Genul Bacillus. 14 1.2.2 Bacillus thuringiensis. 15 1.2.2.1 Factori de virulență: toxinele Cry și Cyt. 17 1.2.2.2 Alți factori de virulență. 19 1.2.2.3 Aplicații biotehnologice. 21 1.3 Bacillus pumilus. 22 1.3.1 Biologie. 22 1.3.2 Aplicații biotehnologice. 24 1.3.2.1 Producția de enzime. 24 1.3.2.2 Producerea de antibiotice. 26 1.3.2.3 Controlul biologic. 27 1.3.2.3.1 Controlul ciupercilor și bacteriilor la plante. 27 1.3.2.3.2 Controlul insectelor. 30 1.3.2.4 Alte aplicații. 32 1.4 Bacillus pumilus 15.1. 32 2. OBIECTIVE. 37 3. MATERIALE ȘI METODE. 43 3.1 Condiții de cultură pentru tulpini bacteriene. 45 3.1.1 Tulpinile bacteriene și conservarea acestora. 45 3.1.2 Medii de cultură. 46 3.1.2.1 Mediu bogat. 46 3.1.2.2 Mediul de sporulare. 46 3.1.3 Condiții de creștere. 47 3.2 Analiza proteinelor. 47 3.2.1 Tratamentul probelor de proteine. 47 3.2.2 Electroforeza proteinelor. SDS-PAGE. 49 3.2.3 Separarea proteinelor după gradientul de zaharoză. 50 3.2.4 Microscopie. 51 3.2.4.1 Microscopie optică. 51 3.2.4.2 Microscopie electronică de transmisie. 52 3.2.5 Imunobloti. 52 3.2.6 Solubilizarea proteinelor. 54

3.2.7 Analiza și identificarea proteinelor de către MALDI-TOF. 56 3.2.8 Bioanalize cu C. capitata. 56 3.2.8.1 Întreținerea coloniei mediteraneene de muște a fructelor. 56 3.2.8.2 Bioanalize cu larve. 58 4. REZULTATE. 63 4.1 Profilul proteic al tulpinii B. pumilus 15.1. 65 4.1.1 Profilul proteic al unei culturi vegetative. 66 4.1.2 Profilul proteic al unei culturi sporulate. 67 4.2 Separarea proteinelor pe gradienți de zaharoză. 70 4.3 Observarea B. pumilus 15.1 prin microscopie. 79 4.4 Analiza fracțiilor dintr-o cultură de B. pumilus 15.1 prin intermediul imunoblotului. 85 4.5 Solubilizarea proteinelor. 88 4.6 Identificarea proteinelor prin analiza amprentei peptidice sau amprentarea digitală. 92 4.7 Activitatea proteinelor izolate în gradienții zaharozei împotriva larvelor C. capitata. 95 5. DISCUȚIE. 99 6. CONCLUZII. 109 7. MUNCĂ VIITOARE. 115 8. BIBLIOGRAFIE. 121 ANEXE. 141 Analiza și identificarea proteinelor de către MALDI-TOF. 143 37 kda proteină. 143 Proteină 17 kda. 144 Proteină 45 kda. 145 Proteine 60 kda. 146 Proteine 250 kda. 147

ABREVIERI (p/p) Raport greutate/greutate (p/v) Raport greutate/volum (v/v) Raport volum/volum

Aproximativ C grade Celcius µg Micro grame µl Micro litri µm Micrometru 16S Ribozom procariotic subunitate minoră moleculă de ARNr ADN Acid dezoxiribonucleic APS Persulfat de amoniu ARN Acid ribonucleic ARNr ribosomal ARN ATP Adenozin trifosfat Bturingin Cristal Bic Proteină citolitică Da Daltons DNAse Deoxiribonuclează DTT Ditriotreitol EDTA Acid etilendiaminetetraacetic g Grame H 2 O 2 Peroxid de hidrogen HCl Acid clorhidric K 2 MnO 4 Manganat de potasiu kb Kilo baze 5