Secvențierea exomei urmată de genotipare sugerează sypl2 ca genă de susceptibilitate la
- Subiecte
- rezumat
- Introducere
- Subiecte și metode
- Selectarea probei
- Pregătirea și gruparea ADN-ului
- Secvențierea Exome
- Citiți secvențierea mapării, apelarea variantelor și adnotarea funcțională
- Filtrarea și îmbogățirea variantelor pentru obezitate.
- Validarea variantelor prin genotipare
- Analiza statistică a asocierii.
- Rezultate
- Descoperirea variantelor rare prin secvențierea exomei
- Validarea SNV și analiza asocierii
- Discuţie
- Informatie suplimentara
- Documente Word
- Informatie suplimentara
Subiecte
rezumat
Introducere
Tehnologia dezvoltată recent de secvențiere cu randament ridicat completează matricile SNP și arată puterea de a detecta variantele care cauzează boli rare prin secvențierea profundă a tuturor exonilor cunoscuți. 7, 8, 9 Această revoluție a tehnologiei promite să elucideze boli complexe, permițând o căutare a genomului întreg cu frecvență joasă și variante rare și presupuse funcționale. Secvențierea exomei ar putea fi mai eficientă atunci când este aplicată pacienților cu forme mai extreme de boli comune, cum ar fi obezitatea morbidă; în primul rând, crește șansele de a obține o asociere semnificativă pentru variantele rare cu penetranță ridicată; în al doilea rând, variantele genetice din secvența de codificare a proteinelor ar putea fi mai susceptibile de a avea un impact puternic asupra fenotipului decât variantele din regiunile intergenice.
În acest studiu, am folosit secvențierea exomei pentru a detecta variante de gene îmbogățite cu frecvență joasă și rare la subiecții adulți obezi morbid și le-am validat împotriva adulților mai mari fără obezitate. Am motivat că, în acest fel, vom îmbogăți genele obezității printre cazuri și le vom filtra în controale. Aici raportăm o variantă asociată cu obezitatea cu frecvență scăzută în regiunea de codare a genei sinaptofizinei tip 2 (SYPL2).
Subiecte și metode
Selectarea probelor
Masă completă
Controalele non-obeze pentru secvențierea exomei au avut scolioză. În caz contrar, toți ceilalți subiecți de control au fost sănătoși conform auto-raportului. A existat o supra-reprezentare a femeilor în cohortele studiate. Femeile obeze au mai multe șanse să solicite sfatul medicului pentru obezitatea lor. Scolioza este mai frecventă în rândul femeilor. Subiecții erau de origine europeană și locuiau în Suedia. Studiul a fost aprobat de comitetele etice locale și toți subiecții și-au dat consimțământul informat pentru a participa.
Pregătirea și gruparea ADN-ului
ADN-ul genomic a fost preparat din PBMC utilizând trusa QiAmp DNA Blood Maxi (Cat. Nr. 51194, Qiagen, Hilden, Germania). Puritatea și calitatea ADN-ului au fost confirmate prin raportul A260/280> 1,8 în Nanodrop (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, SUA) și electroforeza pe gel de agaroză. Concentrația ADN-ului a fost măsurată de Qubit (Life Technologies, Stockholm, Suedia). Ulterior, am luat 0,8 μg din fiecare probă de ADN și le-am împărțit aleatoriu în 10 grupe, fiecare cu 10 probe din cazuri obeze sau martori. Concentrațiile de probe de ADN colectate au fost măsurate cu Qubit și probele au fost prelevate pe gel de agaroză.
Secvențierea Exome
Secvențierea Exome a fost efectuată la Laboratorul Science for Life (SciLifeLab), Stockholm, Suedia. Fiecare bibliotecă de ADN a fost preparată din 3 ug de ADN genomic grupat. ADN-ul a fost tăiat la 300 bp cu un instrument Covaris S2 și îmbogățit cu kitul SureSelectXT Human All Exon 50 Mb și o stație de lucru Agilent NGS conform instrucțiunilor producătorului (SureSelectXT Automated Target Enrichment for Illumina Paired-End Multiplexed Sequencing, versiunea A, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, SUA).
Pooling-ul a fost efectuat pe un sistem de construire a clusterului cBot utilizând un kit de construire a clusterului de citire finală împerecheat HiSeq conform instrucțiunilor producătorului (Illumina, San Diego, CA, SUA). Probele au fost secvențiate pe un Illumina HiSeq 2000 ca citiri împerecheate la 100 bp/citire (Illumina). Toate benzile au fost îmbogățite cu o bibliotecă de control 1% phiX, cu excepția benzii 8, care era 2% phiX. Cursele de secvențiere au fost efectuate conform instrucțiunilor producătorului. Conversia de bază a fost făcută folosind Illumina OLB v1.9 (Illumina).
Citiți secvențierea mapării, apelarea variantelor și adnotarea funcțională
Citirile secvențiale au fost aliniate la secvența de referință umană curentă (ansamblul hg19, NCBI build 37) (//hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/chromosomes/) utilizând Alineatorul Burrows-Wheeler (BWA versiunea 0.6.1,//bio-bwa.sourceforge.net/, Li și Durbin 12) cu un parametru de tăiere citită - q de 20. Variantele de secvență au fost invocate de funcția de acumulare multiplă a samtools-0.1.18 (//samtools.sourceforge. net /), cu o calitate minimă a cartografierii de 20 și o adâncime minimă de citire de 5 × pentru filtrare. Duplicatele PCR au fost eliminate folosind samtools înainte de așa-numita variantă. Pentru adnotarea funcțională a variantelor de secvență, am folosit annovar (//www.openbioinformatics.org/annovar/, Wang și colab. 13) pentru a integra informații dintr-o varietate de baze de date în domenii publice, cum ar fi referința genei (/ /hgdownload.soe . ucsc.edu/goldenPath/hg19/database/refGene.txt, 2013), dbSNPs (SNP135, //hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/database/snp137.txt.gz) și proiectul 1000 Genome (//www.1000genomes.org/).