Regulile de interacțiune caveolină kv1

Subiecte

rezumat

Introducere

Aici, studiem influența Cav asupra orientării plutei lipidice a canalelor Kv1, analizând funcția unui posibil motiv CBD conservat în familia Shaker. Atât Kv1.3, cât și Kv1.5 vizează plute lipidice, dar numai Kv1.3 a interacționat eficient cu Cav prin CBD, unde această asociere este esențială pentru localizarea canalului în aceste domenii. Mai mult, comportamentul și activitatea Kv1.3 au fost condiționate de prezența Cav1. Prin urmare, prezența unui CBD în apropierea T1 a Kv1.3 are consecințe funcționale importante pentru fiziologia canalului Kv1.3.

Rezultate

Dependența diferențială a caveolinului de partiția Kv1.3 și Kv1.5 a plutelor lipidice

Lizatele proteice totale HEK Cav1 obținute la 24 de ore după transfecție cu canalul indicat (marcat cu YFP) au fost imunoprecipitate împotriva caveolinului. Probele separate prin SDS-PAGE și imunoblotate (IB) împotriva GFP (canal) și anticorpi caveolin. ( LA ) Diagrame schematice ale canalelor trunchiate Kv1.3 și ale himerelor Kv1.3-Kv1.5. Domenii Kv1.3: butoaie albe și linii negre. Domenii Kv1.5: butoaie gri și linii gri. ( ) Materiale de pornire. Panoul superior, filtrele au fost imunoblotate împotriva GFP (canale). Panoul inferior, filtrele au fost testate împotriva Cav pentru a demonstra imunoprecipitarea Cav. ( C ) Imunoprecipitați. Imunoprecipitarea nu a fost observată în absența anticorpului (IP-).

Imagine la dimensiune completă

Caveolin 1 interacționează cu Kv1.3 printr-o semnătură CBD situată la terminalul N al canalului

Izolații de plute lipidice realizate în HEK Cav- (panouri stânga) și HEK Cav1 (panouri dreapta) care exprimă Kv1.3CBD ( LA ) și canale Kv1.5CBD mutante ( ) (166 FQRQVWLLF 174 la AQRQVGLLA și 232 FQRQVWLIF 240 la AQRQVWLIF 240 la AQRQVWLIF 240 respectiv). ( C ) HEK Cav1 care exprimă Kv1.3 sau Kv1.3CBD a fost imunoprecipitat împotriva caveolinului (IP: Cav1) în prezența (+) și absența (-) anticorpului caveolin. Probele au fost separate prin SDS-PAGE și imunoblotate împotriva Kv1.3 (IB: Kv1.3) și caveolin (IB: Caveolin) SM: materie primă; SN: supernatant; PI: imunoprecipitat.

Imagine la dimensiune completă

Nu am găsit interacțiuni între Kv1.5 și Cav1; cu toate acestea, la convertirea putativului Kv1.5 CBD în cel al Kv1.3 (Kv1.5I239L), am observat o co-imunoprecipitare pozitivă Cav1 Fig. S4. Mai mult, dovezile sugerează că Kv1.5 ar putea interacționa indirect cu caveolinele prin formarea complexelor supramoleculare, inclusiv SAP97 33, 34. SAP97 (proteina 97 asociată cu sinapsă) este un membru al familiei guanilat kinazei asociate membranei (MAGUK), care include și PSD95 (proteina 95 de densitate postsinaptică). Prin urmare, exprimăm Kv1.5 în prezența și absența PSD95 în celulele HEK Cav1. În acest scenariu, Kv1.5 co-imunoprecipitat cu Cav1, numai în prezența PSD95 (Fig. S4). Prin urmare, datele noastre sugerează că, deși integritatea deplină a Kv1.3 CBD este suficientă pentru a interacționa cu Cav1, Kv1.5 necesită proteine ajutătoare.

Discuţie

Dovezile arată că Kv1.3 vizează locațiile specifice ale membranei 35, 36 și schimbările de locație au consecințe patologice 37. Studiul nostru evidențiază mecanismul principal al partiției suprafeței membranei canalului Kv1.3. Raportăm aici că printre canalele Kv1 (Shaker), doar Kv1.3 și Kv1.5 au vizat în mod semnificativ plute lipidice. Cu toate acestea, în timp ce flotabilitatea Kv1.5 a fost independentă de expresia caveolinului, concentrația plutelor lipidice Kv1.3 a crescut într-o manieră dependentă de doză de caveolin. Acest lucru este de relevanță fiziologică, deoarece a fost confirmat la BMDM de la șoareci Cav1 -/-. Mai mult, colocalizarea canalului caveolin a fost mai mare cu Kv1.3 decât cu Kv1.5. În cele din urmă, am identificat clar un CBD care se găsește în domeniul N-terminal al Kv1.3 și este elementul responsabil pentru interacțiunea Cav1 și localizarea plutei lipidice a canalului. Deoarece orientarea plutelor lipidice a fost propusă ca mecanism de reglare a canalelor ionice, 1, 38 rezultatele noastre contribuie la acest câmp în expansiune.

Pe scurt, rezultatele noastre ajută la elucidarea mecanismelor care direcționează canalele Kv1 către microdomenii de suprafață specifice care sunt implicate în reglarea fină a răspunsurilor celulare. Spre deosebire de alte canale neuronale Kv1, Kv1.3 interacționează cu caveolin printr-un CBD situat în domeniul N-terminal al canalului adiacent primului segment transmembranar și în imediata apropiere a domeniului T1 și a sitului de legare Kvβ. Această asociere direcționează Kv1.3 către structuri caveolare care reglează atât dinamica, cât și activitatea membranei canalului.

Metode

Plasmide de expresie și mutageneză direcționată către situs.

Șobolanul Kv1.3 în pRcCMV a fost furnizat de TC Holmes (Universitatea din California, Irvine, CA). Șobolanul Kv1.1 și Kv1.4 în pGEM7 și Kv1.5 uman în construcțiile pBK au fost subclonate în pEYFP-C1 și pECerulean-C1 (Clontech). Himerele Kv1.3/Kv1.5 au fost generate în canalele pEYFP-rKv1.3 și pEYFP-hKv1.5 prin inserarea site-urilor BglII și EcoRI în domeniile N și C ale terminalului canalelor. Mutanții au fost generați folosind kiturile de mutageneză direcționate de site-ul QuikChange (Stratagene). Secvența LoopBAD (BAD, domeniul acceptor de biotină) a fost inserată în prima buclă extracelulară a pEYFP-Kv1.3 într-un site NrI preexistent pentru construcția rKv1.3LoopBAD. E. coli Biotina ligază care conține constructul pBtac_BirA a fost utilizată așa cum s-a descris anterior 54. Rat Cav 1 în pECerulean-C1 a fost furnizat de JR Martens (Facultatea de Medicină a Universității din Florida). Cav1 a fost inserat în pcDNA3 prin digestia Cav-pECerulean (HindIII-BamHI). Construcțiile au fost verificate prin secvențiere.