Livrarea de viruși a ghidurilor CRISPR către protocolul de prostată murină pentru modificarea genei (tradus în
rezumat
Acest protocol descrie o metodă nouă de livrare a virusului la prostata murină. Folosind tehnologia CRISPR/Cas9, supraexprimarea genelor sau livrarea recombinazei Cre, tehnica permite modificarea ortotopică a expresiei genice și implementează un model nou de șoarece pentru cancerul de prostată.
Abstract
Cu o incidență crescândă a cancerului de prostată, identificarea noilor factori tumorali sau modulatori este crucială. Modelele de șoareci modificate genetic (GEMM) pentru cancerul de prostată sunt împiedicate de eterogenitatea tumorii și de dinamica complexă a microevoluției sale. Modelele tradiționale de șoarece de cancer de prostată includ, printre altele, linii germinale și eliminări condiționate, expresia transgenică a oncogenelor și modele de xenogrefă. Generarea de mutații de novo în aceste modele este complexă, consumatoare de timp și costisitoare. Mai mult, majoritatea modelelor tradiționale vizează majoritatea epiteliului de prostată, în timp ce cancerul de prostată uman este bine cunoscut pentru a evolua ca un eveniment izolat doar într-un subgrup mic de celule. Modelele valoroase ar trebui să simuleze nu numai inițierea cancerului de prostată, ci și progresul către boala avansată.
Aici descriem o metodă pentru a ataca unele celule din epiteliul prostatei de celulele transductoare ale particulelor virale. Eliberarea unui virus vizat la prostata murină permite modificarea expresiei genelor în epiteliul prostatei. Cantitatea și tipul de virus vor defini prin prezenta numărul de celule specifice pentru alterarea genetică prin transducție a unor celule pentru inițierea cancerului și a mai multor celule pentru terapia genică. Prin injecție pe bază de intervenție chirurgicală în lobul anterior, distal al tractului urinar, tumora din acest model se poate extinde fără a afecta funcția urinară a animalului. Mai mult, prin vizarea doar a unui subset de celule epiteliale de prostată tehnica permite expansiunea clonală a tumorii și astfel imită inițierea, progresia tumorii umane, precum și invazia prin membrana bazală.
Această tehnică nouă oferă un model puternic de cancer de prostată cu o relevanță fiziologică mai mare. Suferința animalelor este limitată și, deoarece nu este necesară o reproducere suplimentară, numărul total de animale este redus. În același timp, analiza noilor gene și căi candidate a fost accelerată, ceea ce la rândul său este mai rentabil.
Introducere
Detectarea și tratamentul cancerului de prostată s-au îmbunătățit semnificativ în ultimul deceniu. Cu toate acestea, incidența cancerului de prostată este în creștere, din cauza speranței de viață. Cu aproximativ 1,1 milioane de cazuri noi la nivel mondial, este una dintre cele mai frecvente cauze de deces cauzat de cancer la bărbați 1. Cancerul de prostată se dezvoltă lent, dar când cancerul a progresat la o stare metastatică avansată, prognosticul este slab datorită opțiunilor limitate de tratament. Până în prezent, doar câteva gene au fost identificate ca factori comuni ai acestui cancer, iar eterogenitatea și multifocalitatea lor exclud detectarea biomarkerilor și a factorilor determinanți ai bolii 2, 3 .
Tehnicile clasice de generare a GEMM-urilor se deteriorează adesea din cauza complexității, timpului și cheltuielilor de cost. Modelele condiționate au fost utilizate pe scară largă pentru a studia genele candidate pentru cancerul de prostată, care au ca rezultat mortalitatea embrionară atunci când sunt inactivate în linia germinativă 4. Modele mai frecvente implică o recombinază specifică Cre de prostată condusă fie de un promotor modificat Probasin 5, fie de PSA 6 integrat în GEMM printr-un crossover suplimentar. În aceste modele, gena de interes va fi vizată în majoritatea celulelor epiteliale de prostată, generând hiperplazie în întregul organ, care poate afecta funcția tractului urinar 7 al animalului .
Eliberarea virală a proteinei Cre prin injectare în lobul anterior al prostatei murine poate rezolva această problemă vizând doar câteva celule 8. Luând în considerare, metoda beneficiază de o gamă largă de posibile variații, cerințe tehnice de laborator, cunoștințe și obiective. Abordările de succes folosind Adenovirus la JunB și Pten 9 sau Lentivirus la Pten și Trp53 10 au fost demonstrate printre altele. Adăugarea transgenelor, cum ar fi luciferaza, constructul viral sau GEMM, va permite, de asemenea, monitorizarea neinvazivă a progresiei bolii prin imagistică bioluminiscentă 11 .
Editarea genomului bazată pe tehnologia CRISPR/Cas9 dezvăluie o nouă oportunitate rapidă pentru studiul cancerului prin generarea rapidă de eliminări somatice 12. Livrarea virală a ARN-urilor unice (sgRNA) direcționate către lobul anterior al prostatei murine stabilește un model fiziologic mai relevant al cancerului de prostată. În acest fel, celulele cu mutații solicitate pot forma clone capabile de expansiune și invazie. Mai mult, folosirea ARN-urilor de ghid pentru diferite gene țintă va genera clone celulare cu modificări în diferite gene. Acest lucru va permite heterogenitatea tumorii și o presiune a selecției naturale asupra progresiei cancerului, care poate dezvălui importanța fiecărei modificări a genelor sau a mecanismelor epistatice.