CONTROLUL CALITĂȚII INTRĂRILOR ȘI A DIETELOR ACVACULTURALE
Pentru:
Juan Carlos Medina B.
Eliezer Castillo
Introducere
Micotoxinele sunt metaboliți secundari cu greutate moleculară mică, produși de ciuperci, care provoacă efecte patologice la oameni și animale.
14.2. Dezvoltarea metodelor imunochimice
Deoarece micotoxinele nu sunt antigenice, primele studii care au fost dezvoltate au fost în sensul realizării conjugării cu proteine sau polipeptide care ar putea servi drept transportori în condițiile optime pentru producerea de anticorpi la iepuri și alte animale. Odată cu progresele tehnologice, anticorpii monoclonali au fost produși împotriva diferitelor micotoxine. Această dezvoltare a crescut în ultimii 8 ani. În tabelul 14.1. este prezentat raportul actual al anticorpilor micotoxinici disponibili.
Așa cum era de așteptat, au fost dezvoltate diferite tipuri de imunoanalize, printre care se evidențiază coloanele ELISA (imunoanalize enzimatice), RIA (radioimunoanalize) și imunoafinitate. Majoritatea acestor metode sunt foarte sensibile, specifice și ușor de utilizat. Cu care a apărut o dimensiune în ceea ce privește metodologia pentru analiza micotoxinei.
Înainte de a continua discutarea diferitelor tipuri de imunoanalize, trebuie să luăm în considerare următoarele:
Deoarece majoritatea imunoanalizelor se bazează pe competiția pentru siturile de legare a moleculelor de anticorpi între toxinele prezente în probă și toxinele marcate caracteristice sistemului, micotoxinele conjugate. Prin urmare, este necesar să aveți o micotoxină perfect marcată pe lângă anticorpul specific din sistemul de testare.
Este necesar să aveți o metodă bună pentru extragerea micotoxinelor și o procedură adecvată pentru separarea toxinelor legate și libere.
Trebuie cunoscut gradul de specificitate al anticorpilor, reticulat, împotriva compușilor analogi.
Deoarece există întotdeauna posibilitatea ca un component al probei să reacționeze cu anticorpii, este necesar să se studieze fiecare tip de matrice în detaliu, înainte de a efectua testele respective.
Procedurile de curățare a extractelor nu trebuie efectuate în majoritatea sistemelor de imunoanaliză. În așa fel încât extractul din matricea solidă să poată fi utilizat direct în test, după diluarea cu o soluție tampon caracteristică sistemului însuși. Cu toate acestea, sensibilitatea determinărilor crește atunci când se utilizează o procedură adecvată pentru curățarea extractelor.
| Aflatoxine: B1, B2, G1 | P-ul meu |
| Metaboliții aflatoxinei B2a, Q1, M1, Ro | P-ul meu |
| Acid ciclopiazonic | P |
| Ergotamina | P |
| Fusarochromanone | P |
| Fumonisin | M |
| Acid kojic | P |
| Ocratoxină A | P-ul meu |
| Toxina PR | P |
| Rubratoxina B | P |
| Acid secalonic | P |
| Sterigmatocistină | P |
| Tricotecenele: DAS, DON, FX, DOVE, NIV, T-2 și metaboliții lor | P-ul meu |
| Zearalenonă | P-ul meu |
| Patulin | P |
Sursa: Chu, 1992.
14.2.1 Radioimunoanalize (RIA)
Procedura de radioimunologie cuprinde incubarea unui anticorp specific simultan cu o soluție a unei probe sau a unei soluții standard de concentrație cunoscută și o cantitate constantă de toxină marcată. După separarea toxinelor libere și legate, radioactivitatea este determinată în fiecare dintre aceste fracțiuni.
Concentrația toxinei din probă este determinată prin compararea acesteia cu o curbă standard, care se stabilește prin reprezentarea grafică a raportului de radioactivități în fracția legată și fracția liberă în raport cu logaritmul concentrației de toxine nemarcate.
Sensibilitatea acestui tip de test pentru micotoxine este rezumată în Tabelul 14.2. Dar, în general, acest test imuno poate detecta 0,25 până la 0,5 ng din toxina purificată. În cazul probelor de alimente, limitele de detecție sunt de 2 până la 5 ppb. Această sensibilitate poate fi îmbunătățită cu o anumită procedură pentru curățarea extractelor sau prin utilizarea markerilor radioactivi cu activitate ridicată, cum ar fi micotoxinele etichetate cu 125 I. Deși această tehnică este un instrument care oferă rezultate exacte, metoda implică utilizarea radioactivității, prin urmare este utilizat exclusiv în laboratoare de cercetare și în unele instalații industriale.
| AFB/AF | Porumb, grâu, arahide | 1 - 10 |
| Aflatoxina M | Lapte | 0,01 |
| Deoxinivalenol | Porumb, grâu | 300 |
| Ocratoxină A | Porumb, grâu | 5 |
| Toxina T - 2 | Porumb, grâu | 2,5 - 50 |
| Zearalenonă | Porumb | 100 |
Sursa: Chu, 1992
14.2.2 Imunoanalize competitive legate de enzime (ELISA)
În general, sistemul ELISA este de aproximativ 10 până la 100 de ori mai sensibil decât testele radioimuno pentru micotoxinele purificate. Posibilitatea de a detecta valori de până la 2,5 pg de micotoxine pure.
Dezvoltarea actuală a acestor sisteme ELISA permite efectuarea determinărilor de aflatoxină, toxină T-2 sau deoxinivalenol în mai puțin de o oră după procesul de extracție. Sensibilitatea sistemului ELISA este îmbunătățită atunci când se efectuează procese de purificare a extractelor. Sensibilitatea sistemelor ELISA este specifică pentru fiecare micotoxină, Tabelul 14.2. prezintă o relație despre aceste informații.
În testul ELISA indirect, un conjugat format din micotoxina legată de o proteină sau o polipeptidă este imobilizat pe o placă de microtitrare. Placa este incubată cu anticorpul specific în prezența și absența micotoxinelor omoloage. Cantitatea de anticorp legat de conjugatul proteic imobilizat pe placă este apoi determinată prin reacția cu un complex enzimatic IgG, care este disponibil comercial, și reacția ulterioară cu substratul. Astfel, toxina din probe și toxina din faza solidă concurează pentru aceleași site-uri de legare cu anticorpul specific în soluție.