Condiții microbiologice pentru cultivarea Helicobacter Pylori
Condiții microbiologice pentru cultivarea Helicobacter pylori
Martín Alonso Bayona Rojas, Bact., Esp., Msc. (1)
(1) Profesor al Școlii de Medicină, Grupul de Cercetare Biomedică și Genetică Aplicată (GIBGA). Universitatea de Științe Aplicate și a Mediului U.D.C.A. Bogota Columbia. e-mail: [email protected]
Data primirii: 17-09-12 Data acceptată: 16-04-13
Diagnostic în timp util și cultură a Helicobacter pylori Este de o mare importanță studierea caracteristicilor creșterii sale, precum și contribuția la cunoașterea epidemiologiei clasice și moleculare, a diversității genetice și a susceptibilității la antibiotice. Omniprezența și importanța acestui microorganism ca agent patogen la nivel mondial ne obligă să luăm în considerare și să propunem alternative eficiente pentru izolarea și identificarea curentă a acestuia în laboratoarele de microbiologie. Această revizuire a avut drept scop descrierea literaturii referitoare la condițiile necesare cultivării acestui microorganism în laborator.
Cuvinte cheie
Helicobacter pylori, microbiologie, izolare, cultură microbiană.
FUNDAL
Se calculează că H. pylori infectează între 50 și 75% din populația lumii. Din fiecare 10 persoane infectate de acest microorganism, doar una suferă de boală și nouă nu o dezvoltă niciodată. Infecția este asociată etiologic cu prezentarea ulcerelor peptice, fie gastrice, fie duodenale, și cu dezvoltarea unui tip special de limfom gastric numit maltom; în același mod, participă la lanțul etiologic multicauzal al dezvoltării cancerului gastric (1). De fapt, Organizația Mondială a Sănătății a clasificat acest agent patogen ca fiind cancerigen biologic pentru om (categoria 1), în care cea mai mare incidență a infecției apare în timpul copilăriei în țările în curs de dezvoltare și pare să fie legată de condițiile economice. Și igienico-sanitare nefavorabile (2, 3). Diferitele tulpini par a fi asociate cu diversitatea în virulența lor și interacțiunea cu factori, inclusiv originea etnică, dieta slabă, supraaglomerarea, geografia și vârsta (4).
Acest articol prezintă o revizuire a aspectelor microbiologice orientate către culturi și a factorilor implicați în acesta. Pentru căutarea bibliografică, au fost explorate următoarele baze de date: Medline, Proquest, Embase, Jstore, Pubmed, Hinary, Springer, Nature, Science online și Oxford Journal și în reviste private precum Plos, Nas și Imbiomed. Termenii au fost combinați: Helicobacter și întreținere, suplimente pentru Helicobacter, Mentenanță în laborator, cultură pe mediu solid, sensibilitate la antibiotice.
În Columbia, într-un studiu realizat de Universidad del Valle în finanțare cu Institutul Colombian pentru Dezvoltarea Științei și Tehnologiei, au raportat o prevalență de 69,1% a infecției cu H. pylori în spitalele regionale din 16 departamente din Columbia în probe de biopsie prelevate din endoscopia tractului digestiv superior. În deceniile anterioare, cercetările privind cauzele bolii peptice acide și ale adenocarcinomului gastric s-au concentrat în primul rând pe factorii de dietă, dar descoperirea H. pylori ca agent patogen gastric frecvent, a schimbat conceptele etiologice despre aceste și alte boli gastroduodenale (5).
Studiul H. pylori În țara noastră a început la sfârșitul deceniului precedent și există puține rapoarte despre laboratoare cu experiență în abilitățile microbiologice necesare izolării și cultivării sale (6).
CARACTERISTICI MICROBIOLOGICE
Membrii genului Helicobacter au fost descrise în 1989, colonizează stomacul și intestinul oamenilor și unele specii de animale, este un bacil curbat, microaerofil Gram negativ, are o membrană exterioară și 4 până la 8 flageli polari protejați de o înveliș de structură lipidică. Printre enzimele pe care le produce se numără: ureaza, catalaza și citocrom oxidaza. Ureaza se numără printre factorii de virulență bacteriană ai H. pylori care transformă ureea în NH3 și apă, alcalinizând astfel mediul acid din jur; alți factori sunt reprezentați în lipază, adezine, catalază, factor de activare a trombocitelor, proteina genei asociate citotoxinei Cag A, pic B (care induce citokine) și citozina vacuolizantă Vac A (3, 7).
Pentru cultură, se obțin probe din mucoasa gastrică și probe extragastrice prelevate din placa dentară, rect, vezică și esofag; timpul necesar formării coloniilor se obține între 4 și 7 zile în condiții de: 5-10% 02; 5-10% C02; 80-90% N2, 95% umiditate și 35-37 ° C temperatură. Se cultivă de obicei în medii complexe cu sânge, ser și antibiotice (7).
CONDIȚIILE DE EȘANTIONARE
Protocolul recomandat pentru administrarea biopsiilor la pacienții cu gastrită cronică este cel propus de sistemul Sydney. Trebuie remarcat faptul că H. pylori Se găsește predominant în partea antrală a stomacului, cu excepția persoanelor tratate cu IPP și antihistaminice anti-H2, unde densități mai mari se găsesc în organism. 5 biopsii ar trebui luate după cum urmează: două probe antrale din curburile mai mari și mai mici de 2 până la 3 centimetri proximal de pilor, două probe din corp din curburile mai mari și mai mici la 8 centimetri distal de cardia și o probă de la pornirea de la incisura angularis (8). Folosind acest protocol, bacteriile pot fi detectate la practic toate persoanele infectate (9). Efectuarea unei biopsii este un proces practic nedureros pentru pacient, dar este o procedură care trebuie efectuată de un gastroenterolog expert, urmând protocoalele de etică medicală stabilite. Nu se recomandă efectuarea procedurii la pacienții cu ulcer sângerând, deoarece poate prezenta un risc de sângerare. Toate studiile trebuie să fie aprobate de Comitetul de etică și să aibă consimțământul informat clar.
Au fost utilizate alte probe gastrice, cum ar fi sucul gastric, obținut prin testul de sfoară („testul de sfoară”) și izolarea de vărsături, oferind rezultate diferite. H. pylori De asemenea, a fost cultivat ocazional din probe extragastrice, cum ar fi placa dentară, esofag, rect și vezica urinară.
Aspecte de reținut: dacă pacientul a urmat un tratament cu antibiotice, este necesar să așteptați cel puțin patru săptămâni după ultima doză pentru a obține rezultate satisfăcătoare în ceea ce privește cultura. Forcepsul cu care se efectuează biopsiile trebuie dezinfectat în mod adecvat pentru a evita contaminarea între pacienți; dacă dezinfectarea este prea puternică, aceasta poate afecta viabilitatea bacteriilor.
Probele de biopsie trebuie măcinate sau pulverizate cu o cantitate mică de ser fiziologic înainte de a se aplica pe mediu. Proba omogenă trebuie plasată imediat pe suprafața mediului: trebuie luată cu un mâner și apoi întinsă pe suprafață cu o metodă de împrăștiere pentru izolare (8, 9).
Probele obținute trebuie procesate rapid, deoarece microorganismul este foarte sensibil la mediu. Probele de biopsie (prelevate din antr și din corp) trebuie plasate într-un tub cu șurub steril cu 0,5 ml soluție salină și pot rămâne acolo maximum 6 ore. Dacă se anticipează o întârziere, mijloacele de transport, cum ar fi mediul Stuart, trebuie utilizate și menținute la o temperatură de 4 până la 8 ° C, nu mai mult de 24 de ore înainte de procesare, apoi omogenizate și semănate în duplicat în diferite medii de cultură, inclusiv bulion și agar Brucella, BHI, Mueller Hinton, agar Columbia și soia tripticază completate în general cu ser bovin fetal, lizat eritrocitar, extract de drojdie, peptonă și extract cianobacterian. Sângele (cal, miel, iepure) se adaugă în general între 7 și 10%, iar printre antibioticele care se adaugă mediului se numără: vancomicină, sulfametoxazol, trimetoprim, cefsulodină și polimixină B. Probele pot fi depozitate în bulion de soia tripticază sau adăugat BHI cu 20% glicerol care sunt depozitate într-un congelator la -80 ° C sau lichid N2 (10-12).