B-myb recrutează un complex lin-9 pentru a activa transcripția genei g2m în celulele carcinomului

lin-9

  • rezumat
  • Introducere
  • Rezultate
  • Depleția Lin-9 în celulele carcinomului embrionar murin relevă un defect mitotic
  • Lin-9 este necesar pentru transcrierea genei G 2/M
  • Lin-9 se asociază cu B-Myb, dar nu cu proteinele de buzunar din celulele F9
  • Celulele F9 conțin un complex de tip LINC care conține B-Myb și Lin-9
  • Lin-9 și B-Myb se leagă și activează promotorii genelor G 2/M
  • Siturile de legare specifice de pe promotorul Survivin sunt esențiale pentru legarea Lin-9 și B-Myb
  • Discuţie
  • Conflict de interese
  • Informatie suplimentara
  • Fișiere imagine
  • Figura suplimentară S1
  • Figura suplimentară S2
  • Figura suplimentară S3
  • Documente Word
  • Cifre complementare Legenda
  • Materiale și metode complementare
  • Fișiere Excel
  • Informatie suplimentara

rezumat

Introducere

În acest studiu, am investigat interacțiunea Lin-9/B-Myb în celulele F9 carcinom embrionar murin (CE), care, spre deosebire de celulele studiate anterior, sunt reglementate doar la tranziția G 2/M. În celulele F9 Ca și în embrionul de șoarece celulele stem (ES) (White și colab., 2005), proteinele de buzunar Rb, p107 și p130 sunt menținute într-o stare hiperfosforilată. În consecință, nu există complexe E2F represive și o lipsă de reglare a ciclului celular în G 1/S. Arătăm că suprimarea expresiei Lin-9 prin interferența ARN provoacă oprirea în mitoză și folosim acest sistem pentru a detecta ținte transcripționale Lin-9 . Mai târziu, s-a arătat că Lin-9 și B-Myb cooperează ca activatori transcripționali ai genelor cheie G2/M. În cele din urmă, am identificat un complex B-Myb în celulele F9 care conține majoritatea componentelor identificate anterior în LINC. În mod semnificativ, nicio asociere între proteinele de buzunar și LINC nu a fost detectată în celulele F9 nediferențiate, demonstrând că ciclul celular este reglat de un complex B-Myb/LINC numai în tranziția G 2/M.

Rezultate

Depleția Lin-9 în celulele carcinomului embrionar murin relevă un defect mitotic

Lin-9 a fost epuizat din celulele F9 prin transfecția vectorilor pSuper care codifică ARN scurt ac de păr (shRNA) îndreptat împotriva Lin-9 murin. Celulele de control au fost transfectate cu pSuper exprimând un ARNc luciferază pGL3. PCR cantitativă (qPCR) a demonstrat că shRNA Lin-9 a scăzut semnificativ expresia Lin-9 cu 71% (P

Depleția Lin-9 în celulele carcinomului embrionar F9 relevă un defect mitotic. ( la ) Analiza cantitativă RT-PCR a expresiei Lin-9 în celule sărăcite Lin-9 în raport cu celulele martor. Expresia a fost normalizată la ARPP0 ribozomală. ( ) Analiza Western blot a Lin-9, B-Myb și Cyclin B1 în celule F9 transfectate cu shRNA GL3 (control), shRNA Lin-9 (Lin-9) și shRNA Lin-9 cu vectorul pCAGGS-Lin - 9R rezistent la shRNA (salvare). Β-actina a fost utilizată ca control al încărcării. ( c ) Analiza citometrică în flux (FACS) a celulelor sărăcite de Lin-9, control și salvare colorate cu iodură de propidiu (PI). Săgeata indică celule cu conținut de ADN de 8n. ( d ) Analiza FACS a celulelor de salvare și control epuizate Lin-9 colorate cu antihistone H3 (fosfo S10) -FITC și contracolorate cu PI. Celulele din mitoză sunt în cutie și indicele mitotic este prezentat ca procent de celule. Săgeata indică celulele care conțin 8n ADN care suferă mitoză.

Imagine la dimensiune completă

Pentru a determina dacă celulele sărăcite în Lin-9 s-au acumulat în G 2 sau mitoză, celulele au fost analizate prin FACS și microscopie confocală. Pentru a determina indicele mitotic, FACS a fost efectuat cu celule colorate cu un anticorp la histona H3 fosfoserină 10 (H3 phosphoS10), un marker al mitozei (Paulson și Taylor, 1982). Celulele sărăcite Lin-9 au prezentat o rată mitotică crescută (16,21%) comparativ cu celulele martor (3,59%) și celulele de salvare (3,10%; Figura 1d). O populație suplimentară de celule care conțin 8n ADN a fost observată în epuizarea Lin-9, iar aceste celule au fost colorate pozitiv pentru H3 phosphoS10 indicând faptul că se aflau în mitoză. Microscopia confocală a celulelor colorate cu β-tubulină și anticorp DAPI a arătat o rată mitotică mai mare (14,42%) în celulele cu epuizare Lin-9 comparativ cu celulele martor (3,38%) și cele de salvare (3,07%; Figura suplimentară S2). Celulele sărăcite Lin-9 conțineau nuclei unici și au format un fus bipolar în timpul mitozei, indicând faptul că acumularea de celule 4n și 8n s-a datorat eșecului mitozei mai degrabă decât formării incorecte a fusului sau eșecului citokinezei.

Lin-9 este necesar pentru transcrierea genei G 2/M

Lin-9 este necesară pentru reglarea în sus a genelor G 2/M în celulele stem embrionare. ( la ) Tabelul genelor G 2/M reglat în jos în celulele embrionare F9 sărăcite Lin-9, determinat prin analiza microarray cDNA. Nivelurile de expresie Lin-9 au fost reduse în celulele F9 epuizate Lin-9. ( ) Analiza cantitativă RT-PCR a genelor țintă Lin-9 în celulele sărăcite Lin-9 în raport cu celulele de control pentru a verifica datele microarray. Expresia a fost normalizată la ARRP0 .