Baze atomice pentru activarea terapeutică a canalelor neuronale de potasiu.

atomice

  • Subiecte
  • rezumat
  • Introducere
  • Rezultate
  • Modularea retigabinei canalelor KCNQ printr-un Trp S5
  • Mutageneză nenaturală de aminoacizi a canalelor KCNQ3
  • Pierderea efectelor retigabinei după îndepărtarea legăturii Trp265 H
  • Reglarea fină a forței interacțiunii Trp265-retigabină
  • Contribuții relative ale reziduurilor supuse legării medicamentelor.
  • Identificarea unui donator probabil care leagă H în retigabină
  • Discuţie
  • Metode
  • Biologie moleculară și in vivo suprimarea prostiei
  • Înregistrări cu clemă de tensiune cu doi electrozi
  • Simulări moleculare de legare a retigabinei
  • Analiza datelor
  • Informatie suplimentara
  • Fișiere PDF
  • Informatie suplimentara
  • Comentarii

Subiecte

  • Canalele ionice
  • Proteine ​​de membrană
  • Biofizică moleculară

rezumat

Introducere

Epilepsia este o tulburare comună, eterogenă și adesea debilitantă, care afectează aproximativ 1% din populația lumii. Tratamentul clinic actual al pacienților care suferă de epilepsie se realizează în principal prin medicație, deși este general acceptat faptul că aproximativ 30% dintre pacienții cu epilepsie nou diagnosticați vor fi rezistenți la anticonvulsivantele obișnuite 1, 2. Mai mult, rezistența menționată este corelată cu tipul de atac; de exemplu, s-a raportat că 60% dintre pacienții cu epilepsie focală vor dezvolta și menține rezistența la medicamente 3. Aceste deficiențe au motivat căutarea de noi medicamente antiepileptice, tratamente neconvenționale pentru epilepsie (cum ar fi dieta ketogenică) și identificarea și validarea continuă a noilor ținte farmacologice 4, 5, 6, 7 .

Am folosit mutageneză nenaturală a aminoacizilor pentru a rearanja subtil atomii și electronii din lanțul lateral Trp la locul de legare a retigabinei. Descoperirile noastre demonstrează că repoziționarea atomului de azot indol al KCNQ3 Trp265 elimină complet efectele retigabinei, sugerând că interacțiunea retigabinei necesită formarea unei legături H cu Trp265. Importanța acestei interacțiuni a legăturii H este ilustrată în continuare prin introducerea analogilor Trp fluorurați (cu o înclinație mai mare pentru legăturile H) în KCNQ3 Trp265, rezultând o potență crescută a medicamentului. Folosind analogi multipli ai retigabinei, am identificat o amprentă electrostatică în jurul unui acceptor de legătură H care se corelează cu potența medicamentului. Aceste constrângeri experimentale identifică atomi specifici și forțe chimice implicate în interacțiunile retigabine și evidențiază abordări care pot fi utilizate pentru a ghida îmbunătățirea rațională a medicamentelor existente.

Rezultate

Modularea retigabinei canalelor KCNQ printr-un Trp S5

( la, ) Relații de conductivitate-tensiune pentru ( la ) KCNQ2 (n = 3) și KCNQ2 [Trp236Phe] (n = 6) și ( ) KCNQ3 * (n = 5) și KCNQ3 * [Trp265Phe] (n = 3) canale homomerice împreună cu mutanți indicați (concentrație de retigabină de 100 uM). ( c ) Relații de conductanță-tensiune pentru combinații heteromerice de KCNQ2 și KCNQ3 (raport 1: 1 de mARN injectat, cu sau fără mutații Trp → Phe, așa cum este indicat, n = 5 pentru fiecare combinație), utilizate pentru a genera canale cu un număr redus de legare a retigabinei site-uri. ( d ) Rezumatul modificărilor V 1/2 în saturația retigabinei 100 μM pentru mutațiile KCNQ2 Trp236 și KCNQ3 Trp265, așa cum este indicat (* P 19, 20 .

Am testat dacă poziția KCNQ3 Trp 265 joacă un rol în reglarea răspunsurilor canalului la PIP 2. Folosind fosfataza sensibilă la tensiune ciona intestinalis fosfataza sensibilă la tensiune (CiVSP) pentru a hidroliza PIP 2 la tensiuni depolarizate, am pulsat ovocite printr-o gamă de tensiuni prepulse urmate de un impuls de testare de -20 mV pentru a evalua activitatea canalului după epuizarea PIP 2 27 . Am observat o reducere similară a canalului cu trepte de tensiune de depolarizare în canalele KCNQ3 * și KCNQ3 * [Trp265Phe], indicând faptul că Trp265 nu influențează semnificativ efectele fosfolipidelor anionice asupra funcției canalului (Fig. 1e, f). În general, aceste descoperiri ilustrează faptul că reziduul KCNQ3 Trp265 este esențial pentru efectele retigabinei, dar nu joacă un rol semnificativ în reglarea activării canalului prin tensiune sau PIP 2. .

Mutageneză nenaturală de aminoacizi a canalelor KCNQ3

Pentru a investiga mecanismul de bază al interacțiunilor retigabinei cu acest lanț lateral esențial al Trp, am folosit mutageneză nenaturală de aminoacizi pentru a introduce variante ușor modificate ale Trp (Fig. 2a). Cu această metodă, un codon stop (TAG) este plasat în gena canalului ionic la un loc de interes, iar acest ARNm este co-injectat în ovocitele Xenopus laevis împreună cu un aminoacid sintetic tNAr acilat (purtând un non-aminoacid ). natural) care este ortogonală la căile sintetice ARNt Xenopus 28. Când mecanismul de traducere ribozomală întâlnește codonul de oprire TAG introdus, ARNt sintetic complementar (cu un anticodon CUA) permite citirea aminoacidului adăugat și încorporat în canalele ionice de lungime completă (Fig. 2a) 29 .

Pierderea efectelor retigabinei după îndepărtarea legăturii Trp265 H

Contribuții relative ale reziduurilor supuse legării medicamentelor.

( la ) Au fost colectate relații de conductanță-tensiune pentru canalele mutante KCNQ3 * indicate (n = 4-6 per mutant), în retigabină 0, 100 sau 300 µM. ( ) ΔV 1/2 maxim în 300 μM retigabină măsurată în fiecare canal mutant. Barele de eroare din la, reprezenta sem ( c ) Retigabina a fost cuplată la un model molecular al domeniului formator de pori al KCNQ3 (vezi ref. 19). Două orientări sunt prezentate cu grupul carbamat în vecinătatea Leu314 (modelul „original”) sau Trp265 (modelul „flip”). Cele două modele de legare se suprapun în „suprapunere”, arătând spațiul similar ocupat de ambele orientări de droguri.