5 trucuri pentru a fi expert în Western Blot Labclinics
Biologie moleculară, proteine
Cinci sfaturi practice pentru a deveni expert în Western Blot
Western blot (WB) este în continuare cea mai utilizată metodă de separare și detectare a proteinelor astăzi și, în ciuda acestui fapt, este încă obositor să trebuiască să regleze fiecare experiment. Optimizarea experimentului nostru este crucială și factori precum: calitatea anticorpului, tampoanele de blocare sau eficiența transferului sunt pași cheie pentru a avea succes în proces.
Vom analiza în detaliu ce sfaturi și instrumente ne vor permite să ne îmbunătățim rezultatele.
1. Încărcați cantitatea potrivită de proteine
Cantitatea de proteină care trebuie încărcată în fiecare godeu este variabil și trebuie optimizat de către cercetător, deoarece este un factor care depinde de niveluri de expresie a acelei gene din acel țesut. În plus, trebuie ținut cont de volumul eșantionului recunoaște ceașca aceea. Cu toate acestea, între 10 Da 50 ug proteina din tesut omogenizeaza si intre 10 Da 100 ng proteina totală din probele purificate este de obicei suficientă.
2. Probele mele trebuie reduse sau denaturate?
Revizuirea fișei tehnice a anticorpului este esențială pentru a ști cum ar trebui să ne pregătim probele. De obicei, probele pentru WB sunt proteine denaturat. Proteinele native au o structură terțiară și conformația lor conferă un rol fundamental în funcţie de proteine. Cu toate acestea, această structură va afecta migrație a acestor proteine prin porii poliacrilamida. Denaturarea proteinelor se poate face prin:
- Dodecil sulfat de sodiu (SDS), este un detergent folosit pentru a sparge legăturile de hidrogen și a dezasambla structura terțiară.
- Agenți de reducere precum b-mercaptoetanol sau ditiotreitol (TDT) pentru a reduce punțile disulfură dintre cisteine.
- Căldură probele la 100ºC pentru a denatura și facilita lipirea SDS.