Traumatism cerebral acut la șoareci urmat de protocolul longitudinal de imagini cu doi fotoni (tradus în
rezumat
Trauma cerebrală acută este o leziune gravă care nu a fost tratată corespunzător până în prezent. Microscopia multiphotonică permite studiul longitudinal al procesului de dezvoltare a traumei cerebrale acute și în explorarea strategiilor terapeutice la rozătoare. Două modele de traume cerebrale acute studiate cu imagini cerebrale in vivo cu doi fotoni sunt demonstrate în acest protocol.
Abstract
Introducere
Leziunile cerebrale acute sunt o problemă de sănătate publică, cu o incidență ridicată a leziunilor în accidente auto, căderi sau agresiuni și prevalența ridicată a dizabilității cronice ulterioare. Abordările terapeutice pentru tratarea leziunilor cerebrale rămân pe deplin simptomatice, limitând eficiența îngrijirilor pre-spitalicești, chirurgicale și critice. Acest lucru face ca impactul social și economic al leziunilor cerebrale să fie deosebit de sever. Din mai multe motive, majoritatea studiilor clinice nu au demonstrat o îmbunătățire a recuperării după leziuni cerebrale folosind noi abordări terapeutice.
Modelele animale sunt esențiale pentru dezvoltarea de noi strategii terapeutice către o etapă în care eficacitatea medicamentului poate fi prezisă la pacienții răniți la creier. În prezent, există mai multe modele animale bine stabilite de traumatism cranian, inclusiv impactul cortical controlat 1, leziunea prin percuție fluidă 2, deformarea corticală dinamică 3, scăderea în greutate 4 și leziunea foto 5. Au fost utilizate o serie de modele experimentale pentru studiază unele aspecte morfologice, moleculare și comportamentale ale patologiei asociate cu traumatismele craniene. Cu toate acestea, niciun model animal unic nu este un succes complet în validarea noilor strategii terapeutice. Dezvoltarea unor modele animale fiabile, reproductibile și controlate ale leziunilor cerebrale, este necesară evaluarea proceselor patologice complexe.
Aici, propunem metoda puncției stereotaxice cu un ac de seringă, care ar putea fi combinată cu aplicarea topică simultană a medicamentului, ca model avansat de leziuni locale ale creierului și ca instrument pentru studierea consecințelor fiziopatologice ale traumatismelor acute la nivelul creierului mamiferelor. in vivo.
Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.
Protocol
Toate procedurile prezentate aici au fost efectuate conform ghidului local pentru îngrijirea animalelor (Legea finlandeză privind experimentarea animalelor 62/2006). Licența pentru animale (ESAVI/2857/04.10.03/2012) a fost obținută de la autoritățile locale (ELÄINKOELAUTAKUNTA-ELLA). Șoarecii adulți în vârstă de 1-3 luni, cu o greutate de 24-38 g, au fost ținuți în cuști individuale în facilitățile de animale certificate ale Universității și întotdeauna cu hrană și apă ad libitum.
1. Leziuni cerebrale prin imagistică printr-o fereastră craniană
2. Imagistica cu leziuni cerebrale prin craniul diluat
0,5-1,5 mm în diametru. Utilizați aer comprimat în timpul găuririi pentru a îndepărta resturile osoase. Efectuați perforarea intermitent în timpul procedurii de subțiere, pentru a evita supraîncălzirea indusă de frecare. Răciți burghiul folosind soluția la temperatura camerei și aplicați periodic tampon pe zona subțiată pentru a absorbi căldura.
NOTĂ: Pentru a evita deteriorarea cortexului, nu forați în regiuni mari (> 1,5 mm) pe un strat subțire (abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.
Rezultate reprezentative
Am optimizat două proceduri de operare: 1) fereastra craniană cronică și 2) subțierea craniului, prin imagistica cerebrală post-traumatică la șoareci transgenici. Vederea schematică a preparatelor experimentale este prezentată în figura 1. Punctia traumatica cu 0,3 mm OD (30 g) ac de otel se aplica pe sonda forata (Figura 1A). Pregătirea cu succes a ferestrei craniului permite realizarea de imagini la adâncimi de până la 650 m sub suprafața pionului (Figura 1B), în timp ce subțierea craniului tinde să impună o limită de aproximativ 300 microni (Figura 1C), așa cum s-a demonstrat în reconstrucția 3D a neuronilor piramidali corticali de șoarece Thy1-YFP-H.
Trauma prin puncție are ca rezultat îndepărtarea dendritei și distrugerea rețelelor capilare într-un volum controlat al cortexului cerebral. În primele două zile, zona leziunii crește, iar trauma a provocat sângerarea dendritei și formarea retracției bulbul dendritice în zonele de perilie, așa cum s-a observat folosind microscopia multiphotonă vie. (Figura 2).
Subțierea craniului a fost efectuată la activarea imaginii și migrarea microglială la șoarecii CX3CR1-EGFP imediat după rănire. (Figura 3A). Imaginea SHG oferă un instrument valoros pentru a delimita cu precizie locul leziunii (Figura 3B). Moleculele matricei extracelulare care produc semnale de la grupurile de auto-ajutorare se îmbogățesc foarte mult în parenchimul creierului în traumatismele cu ac. În primul rând, procesele microgliale fine se recuperează, apoi celulele microgliale migrează la marginea locului de vătămare (Figura 3A).
Pentru a estima posibilele leziuni induse de inserarea pipetei de sticlă subțire și livrarea colorantului, am efectuat experimente in vivo cu microscopie cu doi fotoni cu microinjecție Sulforhodamine 101 la șoareci Thy1-YFP-H fără traume cerebrale. Imaginile reprezentative sunt afișate în Figura 4 demonstrați croinjecția de milasit la 3 ore după injectare. Urmele inserării pipetei pot fi văzute în meningele cerebrale vizualizate de SHG (Figura 4A). Astrocitele sunt marcate cu Sulphorodamine 101 introdus prin injecție (Figura 4B). Dendritele care exprimă YFP sub promotorul Thy1 nu demonstrează semne morfologice de vătămare, cum ar fi bulbii de sângerare sau retragere (Figura 4 C).
