Terapia bazată pe celule care utilizează celule care exprimă mir-302-367 reprimă creșterea
Subiecte
rezumat
Principal
Glioblastoamele (GBM) sunt cea mai frecventă formă de tumori cerebrale primare care pot afecta pacienții adulți de orice vârstă. Aceste tumori extrem de vascularizate și infiltrante sunt rezistente la terapiile curente de tratament și de cele mai multe ori duc la un rezultat fatal în mai puțin de 18 luni. Tratamentul actual cu radioterapie și utilizarea temozolomidei oferă rezultate mai bune pentru pacienții cu profil metilat al genei MGMT. 16, 17 Cu toate acestea, eficacitatea acestui tratament, chiar și cu utilizarea moleculelor antiangiogene (bevacizumab), este limitată și această tumoare rămâne incurabilă. Comportamentul agresiv al GBM, inclusiv rezistența la tratamentele actuale și recurențele tumorale, a fost atribuit prezenței celulelor progenitoare asemănătoare GBM (GSC). 18, 19 Prin urmare, noi metode de tratament care vizează în mod specific celulele stem asemănătoare GBM trebuie dezvoltate urgent pentru a eradica aceste tumori incurabile.
Folosind o abordare de profilare a microRNA într-o colecție de culturi primare derivate de pacienți de celule asemănătoare gliomului (GSC), am arătat că clusterul miR-302-367 angajează CMS într-o stare diferențiată ireversibilă și le blochează capacitatea de a iniția și de a progresa tumorile in vivo. 20 În prezentul studiu, am arătat că GSC derivat de la pacient, conceput pentru a exprima stabil și constitutiv clusterul miR-302-367, a fost capabil să elibereze miR-302-367 conținând exosomi. Acești exosomi au fost rapid internalizați de GSC vecin, ducând la modificarea proprietăților de proliferare și proliferare într-o manieră dependentă de miR-302-367. Xenogrefa ortotopică a celulelor care exprimă miR-302-367 împreună cu GSC au modificat în mod eficient dezvoltarea tumorii în creierul șoarecilor, demonstrând potențialul său terapeutic de a bloca recurențele tumorale. Studiul nostru sugerează că terapia pe bază de celule ar putea fi o soluție inovatoare împotriva cancerului.
Rezultate
GSC care exprimă grupul miR-302 reprimă expresia, proliferarea și infiltrarea SHH și SOX2 într-un mod paracrin
Imagine la dimensiune completă
Celulele TG1-miR-302 și GB1-miR-302 secretă exosomi capabili să suprime potența și proliferarea GSC
Pentru a identifica moleculele responsabile de efectul antitumoral, s-a efectuat o ultrafiltrare bazată pe dimensiunea mediului condiționat. Observăm că o fracțiune cu greutate moleculară mare (
Imagine la dimensiune completă
Masă completă
Clusterul miR-302 este transferat în celulele vecine prin secreție de exozomi
Imagine la dimensiune completă
Masă completă
Expresia grupului miR-302 în GSC promovează un efect supresiv al tumorilor paracrine in vivo
Rezultatele acestei abordări pe care le-am obținut la șoareci sunt dovada principiului că terapia bazată pe celule pentru tratamentul cancerului merită să fie luată în considerare. În plus față de GSC, alte celule secretoare de exozomi, cum ar fi macrofagele, pot fi izolate de la pacienți și modificate genetic pentru a exprima stabil molecule terapeutice de ARN pentru tratarea tumorilor.
Transplantul acestor celule direct la locul tumorii în timpul intervenției chirurgicale ar permite administrarea prelungită a exosomilor supresori tumorali la nivel local, evitând injecții periodice grele și stresante de exosomi în pacient.
În concluzie, credem că studiul nostru va suscita interesul pentru utilizarea unei terapii bazate pe celule pentru livrarea in situ a exosomilor terapeutici pentru a ataca GBM uman.
Materiale și metode
Microscop electronic
Difuzie dinamică a luminii (DLS)
Măsurarea DLS a fost efectuată cu un Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments, Malvern, Marea Britanie). Probele au fost diluate în 100 pl de 1 × PBS. Seriile de măsurători 3 × 12 au fost efectuate folosind setările standard (indicele de refracție = 1,33, temperatura = 25 ° C, vâscozitatea = 0,8882 și constanta dielectrică = 79,0). Rezultatele au fost reprezentate grafic folosind OriginPro 2015.
Extracția microveziculelor.
10 6/ml GSC în mediu definit fără microvesicule (mediu NS34 +, Fareh și colab.). După 72 de ore, GSC-urile au fost îndepărtate prin centrifugare (276 xg, 4 ° C, timp de 5 minute) și mediul condiționat a fost colectat, filtrat printr-un filtru de 0,2 μm (Millipore, Fontenay sous Bois, Franța) și concentrat. folosind un filtru centrifugal Amicon Ultra de 100 kDa (Millipore,). Mediul condiționat concentrat a fost utilizat pentru a purifica microvesiculele prin ultracentrifugare la 200.000 x g timp de 110 min.
Reactivi și anticorpi.
Reactivi de cultură celulară, inclusiv DMEM, F12, glutamină, Hepes, bicarbonat de sodiu, N2, G5 și B27, kit de clonare pENTR, LR Clonază II, Superscript II revers transcriptază, DiIC16 (3), DiO16 (3) și reactivi TRIzol au fost achiziționați de la Life Technologies (Cergy Pontolse, Franța). Serul de vițel fetal (FCS) a fost achiziționat de la Hyclone (Brebières, Franța), iar kitul Exoquick a fost achiziționat de la Ozyme (St. Quentin din Yvelines, Franța). Hoechst 33342 și Actinomycin D au fost furnizate de Sigma (St. Quentin Fallavier, Franța), iar Micromount Mounting Media a fost achiziționat de la Leica Biosystems (Nanterre, Franța). Trusa de transcripție inversă Taqman microRNA, Universal Taqman PCR Master Mix și sondele Taqman au fost achiziționate de la Applied Biosystems (Villebon sur Yvette, Franța). Reactivul de detectare a chemiluminiscenței îmbunătățit a fost achiziționat de la Bio-Rad (Marnes la Coquette, Franța).