SEPARAREA ȘI CARACTERIZAREA BIOCHIMICĂ A ENZIMULUI 1,3-PROPANODIOL OXIDOR REDUCTAZA DIN

SEPARAREA ȘI CARACTERIZAREA BIOCHIMICĂ A ENZIMULUI 1,3- PROPANODIOL OXIDORREDUCTAZA PROVENIND DE LA O TÂRGĂ NATIVĂ DE Clostridium spp IBUN 158 NIXYOLLY ALEXANDRA CUCAITA VÁSQUEZ MICROBIOLOG INDUSTRIAL PUJ Cod 186286 MICROBIU DIN COLOMBIA BOGOTÁ DC, COLOMBIA 2010

SEPARAREA ȘI CARACTERIZAREA BIOCHIMICĂ A ENZIMULUI 1,3-PROPANODIOL OXIDORREDUCTAZA DIN O TÂRGĂ NATIVĂ DE Clostridium spp IBUN 158 NIXYOLLY ALEXANDRA CUCAITA VÁSQUEZ Microbiolog industrial P.U.J. Cod 186286 Director DOLLYN MONTO, Profesor asociat al grupului de bioprocese și bioprospecții Linia de microorganisme solventogene POSTGRADUAT INTERFACULTĂȚI DE MICROBIOLOGIE INSTITUTUL DE BIOTECNOLOGIE UNIVERSITATEA NAȚIONALĂ A COLOMBIEI BOGOTÁ D.C, COLOMBIA 2010

Ție, mamă, toată recunoștința și iubirea mea eternă, pentru că m-ai sprijinit și ai fost mereu alături de mine. Fiicei mele pentru răbdarea și dragostea ei, Sorei mele pentru că a fost Prietenul meu necondiționat, pentru Diego și pentru întreaga mea familie pentru a fi sprijinul acestui vis care astăzi este o realitate.

Mulțumiri Dr. Dolly Montoya Castaño pentru regia acestei lucrări, pentru că mi-a oferit posibilitatea de a lucra cu ea și cu un grup de cercetare care a contribuit mai mult decât cunoștințe la viața mea. Colegilor mei membri ai grupului: Julieth Serrano, Ximena Pérez, Natalia Comba, Mauricio Bernal, Herlinda Amaris, María Angélica Peña, Yenny Rocio Martínez, Carlos Barragán, Gernot Gruss, Andres Gutierrez și toți cei care fac parte dintr-un fel în laboratorul de microbiologie. Interfeței postuniversitare de microbiologie, în special Socorro Prieto pentru sprijinul și colaborarea ei. Lui Jhon Florez pentru că mi-a fost ca un înger, pentru colaborarea și răbdarea lui, vă mulțumesc foarte mult. Ana Lucia Castiblanco și Jorge Cortazar pentru disponibilitatea și ajutorul lor. Pentru prietenii mei de la master, în special pentru Vivian, Mery, Carolina, Osquitar și Alexis, pentru că sunt atât de buni prieteni, pentru că m-au sprijinit și am fost mereu acolo pentru a-mi da sfaturi bune. Universității Naționale din Columbia pentru că a făcut posibilă finalizarea și finalizarea acestei cercetări.

CUPRINS REZUMAT 1. INTRODUCERE 1 2. CADRU TEORETIC 3 2.1. Producția de biodiesel 3 2.2. 1,3-propandiol 4 2.3. Sinteza 1,3-propandiolului 5 2.4. Microorganisme din genul Clostridium sp. 7 2.5. Fiziologia formării 1,3-propandiolului în Clostridium sp. 7 2.6. Enzime dehidrogenază 9 2.6.1. Măsurarea experimentală a activității enzimei 11 2.6.2. Detectarea in situ a activității enzimatice a 1,3-propandiol dehidrogenazei 11 2.6.3. Obținerea enzimelor 12 2.6.4. Purificarea enzimei 13 2.6.5. Determinarea concentrației totale de proteine 14 2.6.6. Caracterizarea enzimatică 14 2.7. Progresul grupului de bioprocese și bioprospecții din linia solventului IBUN 16 3. OBIECTIVUL GENERAL 18 3.1. Obiective specifice 18 4. MATERIALE ȘI METODE 19 4.1. Microorganisme, medii și condiții de cultură 19 4.2. Cinetica creșterii 20 4.3. Obținerea extractului de proteine brute 20

4.3.1. Producția de extract de proteină brută 20 4.3.2. Determinarea proteinelor prin metoda fluorometrică 20 4.3.3. Determinarea activității enzimei 21 4.4. Purificarea enzimei 1,3-propandiol dehidrogenază 22 4.4.1. Precipitația proteinelor 22 4.4.2. Separarea și purificarea enzimei 22 4.4.3. Verificarea purificării 22 4.4.4. Analiza proteinelor (PAGINA) 23 4.5. Caracterizarea enzimei 1,3-propandiol dehidrogenază 23 4.5.1. Determinarea temperaturii optime 23 4.5.2. Determinarea pH-ului optim 23 4.5.3. Determinarea parametrilor cinetici Km și Vmax 24 4.5.4. Efectul ionilor divalenți 24 4.5.5. Test preliminar pentru determinarea masei moleculare 24 4.5.6. Determinarea punctului izoelectric 25 5. REZULTATE 26 5.1. Metoda de obținere a extractului de proteine brute 26 5.1.1. Tulpini de lucru 26 5.1.2. Cinetica creșterii 26 5.2. Obținerea extractului de proteine brute 27 5.2.1. Producția de extract de proteină brută 27 5.2.2. Activitatea enzimatică 28 5.2.3. Curba de calibrare pentru NAD + H 29 5.3. Separarea și purificarea enzimei 1,3-propandiol dehidrogenază 29 5.3.1. Precipitații de proteine 30

5.3.2. Separare și purificare 31 5.3.3. Analiza proteinelor (PAGINA) 35 5.4. Caracterizarea enzimei 1,3-propandiol dehidrogenază 36 5.4.1. Efectul temperaturii asupra activității enzimei 36 5.4.2. Determinarea pH-ului optim 37 5.4.3. Determinarea parametrilor cinetici Km și Vmax 37 5.4.4. Efectul ionilor divalenți asupra activității enzimei 38 5.4.5. Test preliminar pentru determinarea masei moleculare 39 5.4.6. Determinarea punctului izoelectric al enzimei 40 6. DISCUȚIE 41 7. CONCLUZII 51 8. RECOMANDĂRI 52 9. REFERINȚE BIBLIOGRAFICE 53 10. ANEXE 61 10.1. ANEXA 1. Curba standard NAD + H 61 10.2. ANEXA 2. Determinarea activității enzimei 63 10.3. ANEXA 3. Curba de creștere a Clostridium IBUN 158B în mediu RCM (Oxoid) 64 10.4. ANEXA 4. Curba de creștere a Clostridium IBUN 158 B în mediu TGY 65 10.5. ANEXA 5. Greutatea uscată vs. Curba de absorbție (600 nm) a Clostridium IBUN 158B în mediu TGY 67 10.6. ANEXA 6. Curba standard pentru determinarea masei moleculare a 1,3-propandiol dehidrogenazei în gelul de poliacrilamidă în condiții de denaturare 68

1,3-propandiol dehidrogenază 39 Figura 19. Procentul de activitate al enzimei 1,3-propandiol dehidrogenază împotriva acțiunii sărurilor de clorură 39 Figura 20. Estimarea masei moleculare a enzimei 1,3-propandiol dehidrogenază în 10% poliacrilamidă geluri în condiții de denaturare 40 Figura 21. Curba NAD + H și ecuația liniei din spectrofotometrul Bio-Rad 61 Figura 22. Curba NAD + H și ecuația liniei în cititorul TECAN ELISA 62 Figura 23. Cinetica timpului necesar pentru a obține o activitate enzimatică mai mare 63 Figura 24. Curba de creștere a Clostridium IBUN 158B în RCM 64 Mediu Figura 25. Curba de creștere a Clostridium IBUN 158B în TGY 66 mediu Figura 26. Curba Greutății uscate Vs Abs 600 nm de Clostridium IBUN 158B în TGY 67 mediu Figura 27. Curba de masă moleculară standard utilizată pentru a estima masa enzimei 1,3-propandiol dehidrogenază colorată cu Coomassie Blue 68 Figura 28. Curba de masă moleculară standard utilizată pentru aceasta Masa enzimei 1,3-propandiol dehidrogenază din Zymograma 68