Proteine de stocare a globulinei dintr-o specie de cereale cu conținut scăzut de proteine
Subiecte
rezumat
Introducere
Materiale și metode
Pacienți și seruri
Extracții de proteine
Proteinele totale de 50 mg-s au fost extrase din semințe de linie Bd21 distrugere pură mărunțită, urmând protocolul lui Dupont și colab. Pe scurt, un tampon de extracție SDS-Tris (pH 6,8) conținând 2% SDS, 10% glicerol, 50 mM DTT și 40 mM Tris-HCI, pH 6,8 a fost utilizat pentru a extrage proteina totală la temperatura camerei timp de o oră cu o temperatură ușoară regulată. doza. vartej. Extractul a fost centrifugat la 16000 g timp de 15 minute. Supernatantul a fost precipitat cu patru volume de acetonă rece ca gheața. Cinci replici biologice au fost utilizate în procesul de extracție.
Electroforeză în gel 2D și imunoblotare
După precipitare, peleta a fost solubilizată cu tampon IEF (8M uree, 2% CHAPS, 100mM DTT, 0,2% CA și 0,1% albastru de bromofenol). Focalizarea isoelectrică a fost efectuată în Immobiline DryStrips pH 7-10 de 7 cm (GE Healthcare), în condiții de rehidratare peste noapte cu 200 µg de proteine în 150 µl de tampon IEF. Au fost utilizate geluri de poliacrilamidă 12% pentru a separa proteinele în funcție de greutatea lor moleculară. 2D GE a fost realizat în trei replici tehnice. Deoarece toate modelele de proteine 2D din diferitele replici biologice și tehnice au fost identice, nano-LC-MS/MS final în linie a fost realizat din trei replici tehnice 2D GE, iar petele au fost combinate.
După ce proteinele GE 2D au fost transferate la membrana ImmobilonP PVDF (Millipore, Billerica, SUA) și blocate timp de 1 oră cu 5% BSA și 0,05% TWEEN20, urmată de o incubare peste noapte la 4 ° C cu seruri de sânge diluate 1:20. Proteinele imunoreactive au fost detectate cu anticorp conjugat de capră anti-IgA peroxidază umană (Sigma-Aldrich-A0295) în prezența substratului cromogen al peroxidazei 4-clor-1-naftol. Petele proteice cu răspuns imun au fost excizate și supuse identificării proteinelor folosind nano-LC-MS/MS online. Anticorpul glutelin de orez împreună cu IgA anti-iepure ca anticorp secundar a fost utilizat în analiza Western blot 2D pentru a confirma prezența globulinelor de stocare a semințelor 14 .
Identificarea proteinelor prin nano-LC-MS/MS online
Analiza secvenței și predicțiile epitopului
Rezultate
( LA ) - Electroforeză în gel 2D a extractului total de proteine din linia consangvinizată Bd21. Proteinele au fost separate pe benzi de 3-10 pH IPG urmate de separare pe geluri de acrilamidă 12%. Petele proteice marcate reprezintă proteine imunoreactive și au fost supuse analizei online nanoLC-MS/MS. Gama de greutate moleculară este marcată pe partea stângă. ( la F ) - imunobloti reprezentativi care utilizează seruri reactive IgA de la pacienți naivi cu boală celiacă ( - HLA DQ2, C - HLA DQ8, D - HLA DQ8/X), pacientul ileocolic afectat de terapie cu boala Crohn ( ȘI ), Pacient cu boală celiacă HLA DQ2 cu dietă fără gluten și control sănătos ( G ). H: Analiza Western blot a extractului total de proteine a fost efectuată folosind glutelina de orez 12 și anticorpii IgA anti-iepure (Sigma-Aldrich) ca anticorpi secundari.
Imagine la dimensiune completă
Masă completă
Două globuline 7S (Uniprot ID I1GPS5 și I1GMC8) au fost identificate predominant din pete. I1GPS5 a fost recunoscut ca un rezultat primar de 14 puncte proteice. Această proteină a prezentat cea mai mare similaritate cu omologii proteinei de depozitare a grâului Globulin-3 și Globulin-3A (Uniprot ID B7U6L4 și I6QQ39). I1GMC8 a fost identificat în două pete proteice și a prezentat cea mai mare similaritate de secvență cu o proteină asemănătoare Globulinei 1S identificată din Triticum urartu (M7ZQM3). Proteina Brachypodium a I1HNH9 a prezentat cea mai mare omologie cu o globulină 11S (A. sativa Q38780). Proteinele I1HMK7 și I1IPF2 au fost identificate ca globuline 12S, cu cele mai puternice asemănări cu proteinele de stocare a semințelor 12S din A. sativa (P12615 și P14812). Sera a reacționat mai frecvent la omologul proteinei de depozitare a grâului Globulin-3A (69,23% - I1GPS5) și la globulinele de tip 11S și 12S (76,92% - I1HNH9 și I1HMK7). Un omolog similar gluteninei cu greutate moleculară mică (69,23% I1HMR6) a fost, de asemenea, extrem de reactiv imun la serul pacienților cu boală celiacă.