Interacțiuni multiple de stabilizare a capsidei dezvăluite într-o structură înaltă

Subiecte

rezumat

Picornavirusul slab studiat, paregovirusul 3 uman (HPeV3) provoacă sepsis neonatal fără terapii disponibile. Structura noastră de rezoluție 4.3-Å a HPeV3 pe cont propriu și rezoluția de 15 Å în complexe cu anticorpi monoclonali umani Fab demonstrează structura așteptată a capsidei picornavirusului cu trei caracteristici distincte. În primul rând, 25% din genomul ARN HPeV3 de la 60 de situri este foarte ordonat, confirmat de reconstrucția asimetrică, și interacționează cu regiunile conservate ale proteinelor capsidei VP1 și VP3. În al doilea rând, termenul VP0 N stabilizează suprafața interioară a capsidei, spre deosebire de alte picornavirusuri în care la ejecție, cum ar fi VP4, formează un canal de translocație ARN. În cele din urmă, buzunarul hidrofob al VP1, locul de legare al medicamentului antipicornaviral, pleconaril, este blocat și, prin urmare, nepotrivit pentru dezvoltarea antivirală. Luate împreună, aceste rezultate sugerează o direcție pentru dezvoltarea anticorpilor neutralizanți, a medicamentelor antivirale bazate pe interacțiunile ARN-proteină și disecția asamblării virusului pe baza nucleației ARN.

Introducere

Picornaviridae este o familie de viruși ARN monocatenari, cu simulare pozitivă, icosaedrică. Parechovirusul A este o specie din această familie cu 16 genotipuri și este în principal asociat cu infecții ușoare la om, în special la copii. Cu toate acestea, un agent patogen emergent, parevirusul 3 uman (HPeV3) poate provoca infecții grave în sistemul nervos central, cum ar fi meningita 1, și este o cauză principală a sepsisului neonatal 2. Nu există antivirale sau vaccinuri disponibile pentru combaterea infecției cu HPeV. Spre deosebire de multe alte picornavirusuri, HPeV-urile sunt slab caracterizate atât în ceea ce privește structura, cât și funcționalitatea, cu excepția HPeV1, unde este cunoscut receptorul 3. Diferențele mari de tropism prezentate de HPeV3 comparativ cu celelalte HPeV, fac esențială investigarea proprietăților structurale ale HPeV3 pentru o mai bună înțelegere a patogenezei sale și a unei posibile legări a receptorilor.

Folosim microscopia crioelectronică și reconstrucția imaginii pentru a analiza structura HPeV3 de la sine și în complex cu un anticorp monoclonal Fab uman. Structura virionului arată că medicamentele care leagă buzunarul VP1, cum ar fi pleconarilul, este puțin probabil să se lege de HPeV; că VP0 este o proteină importantă pentru stabilizarea suprafeței interioare a capsidei și, în cele din urmă, că ansamblul HPeV este probabil controlat de interacțiuni multiple ale genomului cu capsida, prin aminoacizi conservați în VP1 și VP3 și structuri stem și bucle în ARN. Izolăm și caracterizăm un anticorp monoclonal uman specific pentru HPeV3, care ar putea fi foarte util pentru a avansa diagnosticul virușilor și a studia interacțiunile virus-gazdă.

Rezultate si discutii

Structura HPeV3

Imagine la dimensiune completă

Structura ordonată a ARN-ului HPeV3

Imagine la dimensiune completă

Buzunar hidrofob VP1

Medicamentul antiviral, pleconarilul și derivații săi blochează în general infecțiile cu enterovirus, cum ar fi EV-D68 (ref. 4). Aceste medicamente expulzează lipida („factorul de buzunar”) prezent în buzunarul hidrofob al β-butoiului VP1 și blochează învelișul de ARN prin stabilizarea capsidei 4. Canalul către buzunarul hidrofob din HPeV3 VP1 este blocat de trei lanțuri laterale mari conservate Y133, F163 și Y164 (Fig. 1f și 3) comparativ cu EV-D68 (ref. 4). Prin urmare, putem explica observațiile conform cărora pleconarilul nu funcționează în clinica 2 și putem prezice că astfel de factori de buzunar nu vor funcționa împotriva oricărui HPeV secvențiat până acum.

HPeV3 - Structură complexă Fab

Am izolat un anticorp monoclonal uman specific HPeV3, AT12-015, care s-a legat de izolatele HPeV3 152037, A308/99 și două izolate clinice din celulele infectate. Nu a neutralizat 152037 într-un test bazat pe liniile celulare Vero. Structura izolatului HPeV3 152037 a fost rezolvată în complex cu Fab AT12-015 (Tabelul suplimentar 1; Fig. 4a; Fig. Suplimentară 1). Moleculele Fab recunosc un epitop conformațional pe marginea butoiului (Fig. 4a). Contribuțiile provin din regiuni atât în VP3 (bucle hZβB, βChA, βEβF și βGβH), cât și în VP1 (βBβC, βCβD și βEβF, C) conservate în principal în HPeV3, ceea ce explică specificitatea anticorpului la acest genotip (Fig. 3) . Amprenta Fab se întinde pe terminalul VP1 C, unde multe alte HPeV conțin un motiv RGD pentru a se lega de receptorii lor de integrină (Fig. 3 și 4b) 3. Deoarece AT12-015 este specific pentru HPeV3 și nu s-a legat de niciunul dintre celelalte genotipuri HPeV testate, ar putea fi foarte util în avansarea diagnosticării virusului și studierea interacțiunilor virus-gazdă. O comparație suplimentară cu epitopii serurilor de pacienți neutralizanți ne-ar putea ajuta să înțelegem mecanismul de neutralizare la pacienți 13 .

( la ) Reprezentarea izosurfială a culorii radiale a complexului HPeV3-Fab AT12-015 la rezoluția de 15 Å prezentată la 1,5σ peste pragul mediu. Moleculele Fab (roșii) se leagă în jurul regiunii canionului. ( ) Foaia de parcurs HPeV3. Amprenta Fab (contur roșu) se mapează la VP3 (verde) și VP1 (roșu).

Imagine la dimensiune completă

În general, această lucrare arată interacțiuni ARN-capsidă stabilizatoare multiple ca o nouă țintă pentru medicamentele cu parevirus. Dezvăluim stabilitatea neobișnuită a acestor capside la nivelul intra-pentamerului prin interacțiunile VP3 și la inter-pentamerul prin VP0 și propunem că mecanismul de acoperire a genomului HPeV va fi semnificativ diferit de alte picornavirusuri.

Metode

Purificarea și inactivarea virusului.

HPeV1-Harris și HPeV2-2008 au fost furnizate de Institutul Național Olandez pentru Sănătate Publică și Mediu, Bilthoven, Olanda. HPeV4-251176, HPeV5-552322, HPeV6-550389 și două izolate clinice HPeV3 au fost obținute de la Laboratorul de virologie clinică, Centrul Medical Academic, Amsterdam, Olanda. Pentru stocurile de virus HPeV1, HPeV2, HPeV3 A308/99 (tip cadou Hiroyuki Shimizu și Miyabe Ito) și HPeV4-6 au fost cultivate într-o linie celulară HT29 în mediul esențial minim Eagle cu acid L-glutamic (0, 2 ×), aminoacizi neesențiali (1x), streptomicină (0,1 μg ml -1), penicilină (0,1 μg ml -1) și 2% FBS inactivat la căldură (celulele HT29 au fost menținute în mediu conținând 8% FBS căldură inactivată). Aceste tulpini au fost utilizate în testele de legare și neutralizare a anticorpilor AT12-015.