Disecția și analiza în aval a embrionilor Zebra Finch în etapele timpurii ale protocolului de dezvoltare
Abstract
Ciuperca zebră (Taeniopygia guttata) a devenit un organism model din ce în ce mai important în multe domenii de cercetare, inclusiv comportamentul toxicologic 1, 2, 3 și memoria și învățarea 4,5,6. Fiind singura pasăre cântătoare cu un genom secvențiat, cinteza zebră are un mare potențial de utilizare în studiile de dezvoltare; Cu toate acestea, etapele timpurii de dezvoltare a cintezelor zebră nu au fost bine studiate. Lipsa cercetării în dezvoltarea cintebrelor zebră poate fi atribuită dificultății disecării oului mic și a embrionului. Următoarea metodă de disecție minimizează deteriorarea țesutului embrionar, permițând investigarea morfologiei și a expresiei genelor în toate etapele dezvoltării embrionare. Acest lucru permite atât imagistica în câmp luminos, cât și în fluorescență a embrionilor, utilizarea acestora în proceduri moleculare, cum ar fi hibridizarea in situ (ISH), testele de proliferare celulară și extracția ARN pentru testele cantitative, cum ar fi REA. ). Această tehnică permite cercetătorilor să studieze etapele incipiente ale dezvoltării care anterior erau dificil de accesat.
Introducere
Scopul general al acestei tehnici este de a obține embrioni de ciupercă zebră (Taeniopygia guttata) din stadiile incipiente ale embriogenezei pentru utilizare într-o gamă largă de studii de dezvoltare. Cintezele zebră au devenit modelul predominant al organismului păsări cântătoare și au fost utilizate pe scară largă într-o varietate de domenii, inclusiv toxicologia 1,2, comportamentul 3, memoria și învățarea 4,5,6, neuroanatomia comparată 7,8 și dezvoltarea limbajului la 9,10. Fiind singura pasăre cântătoare cu un genom secvențiat, cinteza zebră permite studiul genetic și molecular al ordinului Passeriformes, care reprezintă mai mult de 50% din speciile de păsări cunoscute 11, 12,13.
În ciuda utilizării cintezelor de zebră adultă și juvenilă într-o gamă largă de domenii, s-au efectuat puține studii pe embrioni de ciuperci de zebră, în special în primele etape de dezvoltare. Acest lucru poate fi atribuit dimensiunilor reduse ale ouălor și embrionilor, precum și statutului său mai recent de 14,15,16 organisme model pentru studiile în care puiul (Gallus gallus domesticus) a fost folosit anterior ca 17.18.19.20 .21 sistem model predominant. Cu toate acestea, ca elevi nonvocali, puii nu sunt un model model adecvat pentru studierea bazei genetice a învățării vocale, a dezvoltării învățării vocale, a eredității, a comportamentului și a circuitelor ganglionare-corticale bazale implicate în învățare.
Este important să rețineți că embrionii de ciuperci zebra sunt mult mai delicate și mai ușor de deteriorat decât embrionii de pui în timpul procedurilor de disecție și moleculare. În special, este necesară o îngrijire mai mare atunci când se efectuează etapele de permeabilizare la embrioni de ciuperci zebra. Detergenții puternici și enzimele care nu ar afecta un embrion de pui pot dăuna embrionilor de ciuperci zebra. În ceea ce privește îngrijirea generală, este necesar să așezați ouăle de ciuperci de zebră în cupe mici înainte de a le introduce într-un incubator pentru a preveni ruperea lor atunci când se rostogolesc în timpul incubației.
Cintezele zebră sunt supuse studiilor comportamentale, se reproduc ușor și prolific pe tot parcursul anului în captivitate și învață vocal. Aceste caracteristici permit utilizarea cintezului zebră pentru a răspunde nevoii unui organism model care să integreze aspectele de dezvoltare, genetice și comportamentale ale limbajului. Metodele de disecție detaliate mai jos, împreună cu un ghid de stadializare specific zebră 22 dezvoltate recent, fac din ciuperca zebră un model de dezvoltare standardizat al organismului din ce în ce mai util. Cu toate acestea, obținerea embrionilor în stadiile incipiente poate fi descurajantă. Acest protocol permite cercetătorilor să obțină cu ușurință embrioni în stadiu incipient. Studiile care investighează dezvoltarea timpurie și baza de dezvoltare moleculară a comportamentelor complexe la cinteza zebră sau efectele toxicologice asupra dezvoltării la alte păsări mici, trecătoare, vor găsi utilă această metodologie de disecție.
Protocol
Declarație de etică: metodele au fost efectuate pe cinteze de zebră domesticite din colonia de reproducere de la Colegiul William și Mary. Toate procedurile au respectat liniile directoare RSPCA 23 și au fost aprobate de Colegiul William și Mary OLAW (Office of Laboratory Animal Welfare) Animal Welfare Assurance (# A3713-01) și au primit aprobarea Comitetului instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor (IACUC) (# 2013-06 -02-8721-dacris).
1. Colectarea și incubarea ouălor
2. Îndepărtarea embrionului din ou
3. Separarea embrionilor de țesutul extra-embrionar
4. Testul de proliferare celulară EdU. Incorporarea și detectarea EdU în embrionii Zebra Finch.
5. EdU "faceți clic" Protocol de reacție
Următorii pași sunt efectuați pe flacoane de sticlă.
Rezultate reprezentative
Înainte de disecție, EdU se injectează într-un ou în ziua 2 și se lasă să se incubeze peste noapte. După disecția și fixarea embrionului cu 16 stadii 22, EdU a fost vizualizată folosind chimia „clic”, permițând detectarea celulelor proliferante așa cum se vede în Figura 6 (A, B, C). Este important să monitorizați cu atenție punctele de timp atunci când plasați ouăle în incubator și în timpul disecțiilor, deoarece expunerea la metilmercur sau efectuarea testului EdU pot întrerupe progresia dezvoltării. Injecția a fost făcută devreme în ziua 0, care a fost ziua recoltării, așa cum se specifică în pasul 1.3. Acest embrion a fost disecat aproximativ 38 de ore mai târziu (etapa 7-22). S-a constatat că rata de supraviețuire este de aproximativ 90% (aceeași viteză ca embrionii martor), atâta timp cât cantitatea de injecție a fost sub 478 nl.
Această metodologie permite, de asemenea, disecția pentru extracția ARN-ului de înaltă calitate. După disecția embrionilor din stadiul 16 22, s-a efectuat o extracție a ARN conform protocolului producătorului, fără a fi necesară optimizarea, așa cum se vede în Figura 7. Îndepărtarea membranei gălbenușului nu a fost necesară pentru extracția ARN și aplicațiile ulterioare QRT-PCR.