Derivarea fără hrană a celulelor progenitoare ale creastei neurale din protocolul celulelor stem pluripotente umane

rezumat

Abstract

Introducere

Celulele crestei neuronale (NC) apar în timpul neurulației vertebratelor între epidermă și epiteliul neuronal. Acestea proliferează și migrează pe scară largă pe tot embrionul în curs de dezvoltare și dau naștere la o diversitate impresionantă de tipuri de celule descendente, inclusiv os/cartilaj, schelet craniofacial, nervi senzitivi, celule Schwann, melanocite, celule musculare netede, neuroni enterici, neuroni autonomi, celule cromafine, celulele septului cardiac, dinții și celulele glandulare suprarenale/tiroidiene 6. Prin urmare, celulele NC sunt un tip celular atractiv pentru câmpul de celule stem și importante pentru modelarea unei varietăți de boli, cum ar fi boala Hirschsprung 7, disautonomia familială 8, ca precum și cancerele precum neuroblastomul 9. În plus, acestea oferă posibilitatea studierii in vitro a aspectelor dezvoltării embrionare umane.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Protocol

1. Pregătirea mediilor de cultură, a plăcilor acoperite și a întreținerii hPSC-urilor

Pregătirea 1.1 Suport

Notă: toate mediile de filtrare pentru sterilizare și sunt depozitate la 4 ° C în întuneric timp de până la 2 săptămâni. Numerele de nume ale reactivului pentru companie și catalog sunt listate în Tabelul materialelor.

  1. DMEM/10% FBS: Combinați 885 ml DMEM, 100 ml FBS, 10 ml penicilină/streptomicină și 5 ml L-glutamină.
  2. Mediu HES: Combinați 800 ml DMEM/F12, 200 ml KSR, 5 ml L-glutamină, 5 ml penicilină/streptomicină, 10 ml soluție de aminoacizi esențiali MEM minimă, 1 ml β-mercaptoetanol. Se adaugă 10 ng/ml de FGF-2 după filtrarea mediului.
    ATENȚIE: β-mercaptoetanolul este toxic, evitați inhalarea, ingestia și contactul cu pielea.
  3. Mediu de diferențiere KSR: Combinați 820 ml Knockout DMEM, 150 ml KSR, 10 ml L-glutamină, 10 ml penicilină/streptomicină, 10 ml soluție minimă de aminoacizi esențiali MEM și 1 ml β-mercaptoetanol.
  4. N2-diferențierea unui mediu: Se dizolvă 12 g de pulbere în 980 ml de DMEM/F12 dH 2 O, se adaugă 1,55 g de glucoză, 2 g de bicarbonat de sodiu și 100 mg de transferină umană APO. Se amestecă 2 ml de dH2O cu 25 mg de insulină umană și 40 pl de NaOH 1 N, se adaugă soluția dizolvată în mediu. Adăugați 100 μl de clorhidrat de putrescină, 60 μl de selenită, 100 μl progesteron și aduceți volumul la 1 litru cu dH 2 O.

1.2 Acoperirea plăcilor de cultură

1.3 Întreținerea hPSC-urilor

Notă: hPSC-urile sunt menținute în 0,1% gelatină și fibroblaste embrionare de șoarece inactivate mitotic (MEFS) în mediu HES suplimentat cu 10 ng/ml de FGF-2 așa cum a fost descris anterior 10,12. Celulele ar trebui să se împartă la fiecare 6-8 zile.

  1. Se acoperă un vas de 10 cm cu 8 ml de gelatină 0,1% (în 1x PBS fără magneziu sau calciu) la temperatura camerei timp de 5 minute.
  2. Decongelați MEF congelate rapid într-o baie de apă de 37 ° C. Adăugați 1 milion de MEF la 10 ml DMEM/10% FBS.
  3. Aspirati gelatina si placati celulele. Se incubează la 37 ° C timp de cel puțin 6 ore.
  4. Se aspiră DMEM/10% FBS din placa MEF pregătită, se spală placa cu 1x PBS o dată și se adaugă 10 ml mediu HES suplimentat cu 10 mM dihidroclorură Y-27632. Se lasă mediul să se încălzească la 37 ° C timp de 20 de minute.
    Notă: Pentru diviziunea manuală a hPSC-urilor se folosește o hota cu flux laminar cu microscop încorporat. Cu toate acestea, celulele pot fi trecute folosind metode alternative adecvate.
  5. Sub o capotă cu flux laminar cu un microscop încorporat, separați coloniile separate folosind o macara mobilă și permiteți-le să plutească.
  6. Folosiți o seringă de 1 ml pentru a aspira coloniile plutitoare și trimiteți-le pe placa MEF rece și caldă. Transferați aproximativ un sfert din celule în noul vas. Se incubează la 37 ° C.
  7. Alimentați zilnic celulele cu mediu HES proaspăt.