Structura cristalină a unui receptor uman multi-domeniu netezit în complex cu un super ligand

cristalină

  • Subiecte
  • rezumat
  • Introducere
  • Rezultate
  • Proiectarea rațională a unui nou ligand pentru studii structurale.
  • Arhitectura generală a SMO umane multidominiale
  • Interacțiune multi-domeniu unică
  • Compararea SMO uman cu alți receptori din clasa frizz
  • Discuţie
  • Metode
  • Sinteza TC114
  • Construcție de fuziune SMO-FLA concepută pentru studii structurale
  • Exprimarea și purificarea proteinei de fuziune SMO-FLA
  • Cristalizarea în LCP pentru colectarea de date sincrotrone
  • Colectarea datelor sincrotronei și determinarea structurii
  • Cristalizarea în LCP pentru colectarea datelor XFEL
  • Colectarea datelor XFEL și determinarea structurii
  • Analiza spectrometriei de masă cu schimb de hidrogen-deuteriu
  • Simulare MD
  • Pregătirea proteinelor și construcția sistemului.
  • Simulare dinamică moleculară și analiză de date.
  • Test de semnalizare arici
  • Analiza Western Blot
  • Disponibilitatea datelor
  • Informatie suplimentara
  • Fișiere PDF
  • Informatie suplimentara
  • Fișier de evaluare inter pares
  • Comentarii

Subiecte

  • Biologia dezvoltării
  • Nanocristallografie

rezumat

Receptorul netezit (SMO) aparține clasei Frizzled a superfamiliei receptorului cuplat la proteina G (GPCR), constituind o componentă cheie a căii de semnalizare Hedgehog. Aici prezentăm structura cristalină a SMO umane multidominiale, legată și stabilizată de un ligand instrument TC114 proiectat, utilizând o sursă laser cu raze X de electroni liberi de 2,9 Å. Structura dezvăluie o aranjare precisă a trei domenii distincte: un domeniu de helix transmembranar (TMD), un domeniu balama (HD) și un domeniu extracelular bogat în cisteină (CRD). Această arhitectură permite interacțiuni alosterice între domeniile care sunt importante pentru recunoașterea ligandului și activarea receptorilor. Prin combinarea datelor structurale, simularea dinamicii moleculare și analiza schimbului de hidrogen-deuteriu, demonstrăm că helixul transmembranar VI, bucla extracelulară 3 și HD joacă un rol central în transmiterea semnalului folosind un mecanism de declanșare. GPCR unic, distinct de alte domenii multiple GPCR-uri.

Introducere

Rezultate

Proiectarea rațională a unui nou ligand pentru studii structurale.

SMD trunchiat al CRD (ΔCRD-SMO) a fost anterior cristalizat cu mai multe molecule mici, inclusiv antagoniști și agoniști 3, 8, 9. Acești liganzi și alții nu au produs cristale ale SMO multidominial care conțin un CRD intact fără mutații stabilizatoare. Analiza structurilor anterioare ale ΔCRD-SMO 3, 8, 9 sugerează că cristalizarea unui SMO multi-domeniu ar putea necesita stabilizarea unor părți flexibile specifice ale structurii. De exemplu, am constatat că K395, situat în partea superioară a acului de păr β în bucla extracelulară 2, poate participa la interacțiuni cu reziduuri adiacente sau liganzi 3 și, prin urmare, adoptă probabil o stare conformațională dinamică (Fig. 1a). Prin urmare, presupunem că stabilizarea în continuare a acestei regiuni prin stabilirea unei interacțiuni definite și mai puternice ar putea reduce eterogenitatea conformațională.

( la ) Vedere de aproape a buzunarului de legare LY2940680 în structura ΔCRD - SMO (PBD ID: 4JKV). ( ) Proiectarea și evoluția analogilor LY2940680 pentru studiul cristalizării prin variația substituenților pe inelul aromatic. ( c ) Valorile reprezentative ale Tm pentru LY2940680 și analogii săi conform testului de schimb de căldură CPM. ( d ) Vizualizare în prim plan a buzunarului de legare TC114. TC114 (carboni portocalii) și reziduurile SMO (carboni cian) implicați în legarea ligandului sunt prezentate în reprezentarea barelor. Receptorul este prezentat într-o reprezentare desen animat albastru deschis. Alte elemente sunt colorate după cum urmează: oxigen, roșu; azot, albastru închis; sulf, galben. Legăturile de hidrogen sunt prezentate ca linii magenta întrerupte.

Imagine la dimensiune completă

Analiza structurilor noastre SMO multi-domeniu a indicat faptul că grupul nitro introdus în ligand TC114 interacționează puternic cu K395 în SMO așa cum a fost proiectat și îmbunătățește stivuirea π - π între grupul benzoil și F484 în helix VI (Fig. 1d). Prin urmare, concluzionăm că TC114 stabilizează SMO-ul multidominant prin menținerea elicei VI într-o conformație stabilă care, la rândul său, îmbunătățește interacțiunea hidrofobă între ECL3 extins și canelura CRD hidrofobă. Prin urmare, ligandul proiectat TC114 a atins obiectivul dorit, acționând ca un agent de super stabilizare în testul de stabilitate termică și permițând studiul cocristalizării SMO multidominiale.

Arhitectura generală a SMO umane multidominiale

Structura generală a SMO (Fig. 2a; Fig. Suplimentară 4) împarte un pli canonic GPCR 7TM cu un helix VIII amfipatic care se desfășoară paralel cu planul membranei. CRD se așează în poziție verticală deasupra TMD și este susținut de bucla extracelulară 3 (ECL3) pe o parte și de o buclă de conectare (reziduurile 181–190) pe de altă parte. CRD și TMD sunt conectate prin HD (reziduurile 191-220). Mai mult, pe partea extracelulară a structurii (Fig. 2b), helixul VI se extinde dincolo de suprafața membranei în patru viraje α-elicoidale, iar partea superioară a helixului VI se înclină într-un viraj non-prolin spre CRD, ieșind în canelura sa hidrofobă și îmbinarea unei conexiuni cheie între CRD și TMD. CRD (reziduurile V107, L108, L112), HD (reziduul V210) și ECL3 (reziduurile V494, I496) formează un buzunar hidrofob (Fig. 2c). S-a raportat anterior că acest buzunar constituie un situs de legare a oxesterolului 7, 19 .

( la ) Structura globală a SMO umană în complex cu TC114 determinată într-un XFEL. TC114 este afișat ca bastoane portocalii. CRD, Linker, HD și TMD sunt indicate ca desen animat portocaliu, bleumarin, verde cian și respectiv albastru deschis. Limita membranei este marcată ca o linie punctată portocalie. Glicanii N-legați (NAG) sunt afișați în bare verzi. ( ) Vedere de sus a SMO din partea extracelulară. Un buzunar hidrofob este format din canelura hidrofobă CRD și ECL3 (mâner marin). ( c ) Reziduurile cheie din CRD și ECL3 care definesc buzunarul hidrofob sunt afișate în bare cian și respectiv albastru deschis.

Imagine la dimensiune completă

Interacțiune multi-domeniu unică

Imagine la dimensiune completă

Compararea SMO uman cu alți receptori din clasa frizz

( la ) Vedere laterală a structurilor suprapuse ale CRD SMO umane (hSMO) cu CRD hFzd-4 (PDB ID: 5CL1) și mFzd-8 (PDB ID: 4F0A). SMO, hFzd-4 și mFzd-8 sunt prezentate ca desen animat în albastru deschis, verde lime și respectiv portocaliu. Wnt și Norrin sunt prezentate ca desene animate gri închis și respectiv galben portocaliu. Grupul palmitoil din mFzd-8 CRD este prezentat în sferele marine. ( ) Site-ul 1: Vizualizare de aproape a grupului palmitoil cu reziduuri care interacționează, cum ar fi bastoane portocalii Grupul palmitoil este prezentat pe bețe marine. Reziduurile SMO care alcătuiesc buzunarul hidrofob sunt prezentate în bare albastre deschis, mFzd-8 în bare portocalii. ( c ) Site-ul 2: Suprafața SMO și hFzd-4 CRD. Norrin este prezentat într-un desen animat portocaliu deschis. Gradientul de culoare de la roșu deschis la roșu închis corespunde schimbării proprietății suprafeței de la hidrofil la hidrofob. Situl de legare Norrin de pe suprafața hFzd-4 CRD este marcat printr-un cerc punctat negru cu site-ul corespunzător marcat și pe suprafața SMO.