Pregătirea specimenului de microscopie crio-electronică prin intermediul unui protocol cu fascicul de ioni focalizați (tradus
rezumat
Microscoapele crioelectronice, fie de scanare (SEM), fie de transmisie (TEM), sunt utilizate pe scară largă pentru caracterizarea probelor biologice sau a altor materiale cu un conținut ridicat de apă 1. Se utilizează un fascicul de ioni SEM/focalizat (FIB) pentru a identifica caracteristicile de interes în eșantioane și extrageți o folie subțire, transparentă de electroni, pentru a o transfera la un criotem.
Abstract
Introducere
FIB este utilizat pe scară largă pentru a prepara probe TEM pentru numeroasele sale avantaje 7. Pentru a numi câteva: utilizarea ionilor cu energie ridicată cu incidență aproape normală minimizează efectul ratelor de măcinare diferențiale legate de material; regiunea extrasă din eșantionul în vrac poate fi aleasă cu o precizie mai mică de micron; se îndepărtează o cantitate foarte mică de material. Unele progrese tehnice recente au făcut posibilă utilizarea FIB și pentru prepararea probelor TEM la 2,8-10 temperaturi criogenice. Există mai multe avantaje față de metoda tradițională de preparare a crio-microtomiei 11,12 utilizată în principal pentru probele de materie moale, cum ar fi lipsa deformării mecanice a foii tăiate, absența urmelor de cuțit și posibilitatea de a prepara probe compozite interfețe sau componente hard/soft.
Protocol
Notă: Toți parametrii indicați în acest protocol sunt valabili pentru instrumentele și modelele indicate aici. Unii dintre acești parametri (marcați cu * în text) pot fi diferiți dacă utilizați un alt producător sau model.
1. Implementarea FIB/SEM
2. Congelarea probei
3. Ion de frezare
4. Cryo Transfer la TEM
Rezultate reprezentative
În această lucrare, s-a utilizat: un fascicul dublu FIB/SEM echipat cu un nanomanipulator și un preparat de cameră criogenică; un TEM cu suport de crio-transfer; o stație de transfer crio-prototip. Lamele anticontaminatorului (AC) ale camerei de preparare criocristiană și vârful nanomanipulatorului (NM) au fost modificate de Gatan. În comparație cu o cameră crioconfigurare standard, pinii AC sunt mai mari pentru a oferi un radiator mai mare pentru vârful NM. Mai mult, aparatul de aer condiționat este echipat cu cleme pentru conectarea împletiturilor Cu pentru schimbul de căldură cu vârful NM. Anvelopele FIB/SEM au fost modificate pentru a permite ca NM să fie și să fie în interior, chiar și atunci când camera de probă a fost aerisită. Trebuie remarcat faptul că parametrii utilizați în această lucrare sunt cei mai adecvați pentru echipamentele menționate mai sus; Acești parametri pot fi necesari pentru ajustare atunci când se lucrează cu alte tipuri de echipamente. Pentru a lucra cu acest protocol, trebuie respectate precauțiile normale pentru manipularea sistemelor de criogenică, azot și vid lichid.