Efectul quercetinei asupra ciclului de viață al virusului hepatitei c al țintelor virale de către

Subiecte
rezumat
Introducere
Rezultate
Efectul quercetinei asupra ciclului de viață al VHC în celulele Huh-7,5
Efectul quercetinei asupra ciclului de viață al VHC la hepatocitele umane primare
Atunci când este aplicat direct pe particulele de VHC, quercetina reduce infectivitatea acestora.
DGAT1, un posibil candidat țintă cu Quercetin în setarea infecției cu VHC
Efectul quercetinei asupra dimensiunii LD și localizării subcelulare a proteinei nucleului VHC
Discuţie
Materiale și metode
Reactivi, anticorpi, plasmide și grunduri.
Cultură de celule
Testul de citotoxicitate Quercetin
Producerea VHC, evaluarea și analiza infecției.
Analiza virologică
Niveluri de ARN VHC: teste de replicare
Izolarea ARN-ului, transcrierea inversă și reacția în lanț cantitativă în timp real a polimerazei (RT-PCR)
Producerea pseudoparticulelor VHC
Test de activitate DGAT
Imunofluorescență și colorare roșie ulei O
Evaluarea co-locației
Analiza statistică
informatii suplimentare
Informatie suplimentara
Documente Word
Informatie suplimentara
Comentarii

Subiecte

rezumat

Quercetina este un flavonoid natural, care sa dovedit a avea proprietăți împotriva virusului hepatitei C (VHC). Cu toate acestea, mecanismele exacte prin care quercetina afectează ciclul de viață al VHC nu sunt pe deplin înțelese. Am evaluat efectul quercetinei în diferite etape ale ciclului de viață al VHC în celulele Huh-7,5 infectate cu VHC și în hepatocitele umane primare (PHH). La ambele tipuri de celule, quercetina a scăzut semnificativ i) replicarea genomului viral; ii) producerea de particule infecțioase de VHC și iii) infecțiozitatea specifică a particulelor virale nou produse (85% și 92%, respectiv Huh7,5 și PHH). Mai mult, atunci când este aplicată direct pe particulele de VHC, quercetina și-a redus infecțiozitatea cu 65%, sugerând că afectează integritatea virionului. Interesant este că quercetina a împiedicat reglarea în sus a diacilglicerol aciltransferazei (DGAT) indusă de VHC și localizarea tipică a proteinei nucleului VHC pe suprafața picăturilor de lipide, despre care se știe că este mediată de DGAT. În concluzie, quercetina pare să aibă efecte antivirale directe și mediate de gazdă împotriva VHC.

Introducere

Virusul hepatitei C (VHC) este un virus ARN cu catenă pozitivă învelit, aparținând familiei Flaviviridae 1 cu 7 genotipuri principale 2. Spectrul bolii variază de la hepatită acută la cronică, ciroză și carcinom hepatocelular.

Ciclul de viață al VHC este strâns legat de metabolismul lipidic al celulei gazdă. Mecanismele care leagă infecția cu VHC și metabolismul lipidic includ 3, 4: (a) VHC circulă sub formă de particule îmbogățite cu lipide, numite lipoviroparticule (LVP) 5; (b) LVP sunt particulele de VHC cu cea mai mare infecțiozitate datorită asocierii lor cu lipoproteinele 6; (c) mai mulți receptori implicați în absorbția lipidelor, de exemplu, receptorul lipoproteinelor cu densitate redusă (LDL), Niemann-Pick C1-like 1 (NPC1L1) 7 și SR-B1, sunt implicați în intrarea LVP în hepatocit 8; (d) Asamblarea VHC are loc în imediata apropiere a picăturilor de lipide (LD) 9, 10; (e) Infecția cu VHC promovează acumularea și redistribuirea LD în regiunea perinucleară 11; (f) diacilglicerol aciltransferaza-1 (DGAT1), o enzimă care sintetizează trigliceridele (TG) în reticulul endoplasmatic, interacționează cu proteina de bază a VHC și este implicată nu numai în formarea de LD nou, ci și în producția de VHC infecțios 12; (g) S-a raportat că VHC sechestrează calea de secreție a lipoproteinelor cu densitate foarte mică (VLDL) pentru secreția particulelor virale 13 .

Tratamentul cu medicamente antivirale cu acțiune directă (DAA) a schimbat dramatic rezultatele hepatitei C. De fapt, ratele de răspuns viral susținut (SVR) au atins niveluri record (> 95%) 14, 15 fără evenimente adverse relevante. Cu toate acestea, prețul rămâne unul dintre principalele bariere în calea eradicării hepatitei C, în principal în țările cu venituri mici și medii 16 .

Rezultate

Efectul quercetinei asupra ciclului de viață al VHC în celulele Huh-7,5

Pentru a evalua efectul quercetinei asupra replicării genomului VHC, celulele Huh-7,5 au fost infectate cu VHC produsă de cultura celulară (HCVcc) a tulpinei JFH1 și au fost tratate cu quercetină 50 μM, adică o concentrație la cea care nu s-a observat niciun efect toxic (Fig. S1A, a și b). Quercetina a scăzut semnificativ cantitatea intracelulară de ARN VHC cu catenă negativă, un semn distinctiv al replicării genomului VHC, evaluat în ziua 1 după inoculare (61% ± 5,89% inhibare; p = 0,0084) și în ziua 3 după inoculare (68,38% ± 10% inhibiție; p

Celulele Huh-7.5.1 au fost infectate cu JFH1 timp de 6 ore și apoi au fost tratate cu 50 μM quercetin (JFH1 + Q50 μM), sau DMSO ca control purtător, timp de 24 ore ( la ) sau 72 h ( b, d ). ( a, b ) Celulele au fost lizate pentru a cuantifica ARN HCV cu catenă negativă. ( c, d ) Supernatanții de cultură au fost colectați pentru determinarea nivelului de ARN extracelular HCV și a titrului de infectivitate. Rezultatele sunt exprimate ca procent din controlul vehiculului. Datele sunt prezentate ca valori medii ± SD obținute din trei experimente independente.

Imagine la dimensiune completă

Efectul quercetinei asupra ciclului de viață al VHC la hepatocitele umane primare

PHH-urile au fost infectate cu JFH1 (MOI de 2,5) timp de 6 ore și apoi au fost tratate cu 50 μM quercetină (JFH1 + Q50 μM), sau DMSO ca control purtător, timp de 24 ore ( la ) sau 72 h ( b, c ). ( la ) Celulele au fost lizate pentru a cuantifica ARN HCV cu catenă negativă. ( b, c ) Supernatanții de cultură au fost colectați pentru determinarea nivelului extracelular de ARN VHC și, respectiv, titrul de infectivitate. Rezultatele sunt exprimate ca procent din controlul transportatorului. Datele sunt prezentate ca valori medii ± SD obținute din două până la trei experimente independente.